3min，收集上清液，即为单克隆抗体腹水；饱和硫酸钱盐析法纯化单克隆抗体，-80°C保存；NC-4D12细胞株制备得单抗，即为可专一识别黑尾叶蝉的单克隆抗体。
[0017]实施例2
该单克隆抗体腹水效价检测实验
采用间接ELISA方法测定抗体的效价。将黑尾叶蝉抗原用包被液稀释1000倍后包被整块酶标板，4°C过夜，使其吸附于聚苯乙烯板孔，PBST洗涤三次后用脱脂奶封闭75min。将单克隆抗体NC-4D12倍比稀释加入包被孔，每孔加100 μ L，37°C，lh, PBST洗涤三次后加入按说明书稀释10000倍的辣根过氧化酶标记兔抗鼠(Sigma公司)100 μ L孔，37°C lh,PBST洗涤后加底物显色，2mol/L的H2SO4终止反应后，用酶标仪读取OD值，以与阴性比值大于2为阳性测定单抗腹水效价。
[0018]经检测，确定NC-4D12的效价为稀释1.0X 16倍，确定NC-4D12稀释20000倍用于其他检测实验。
[0019]实施例3
该单克隆抗体的特异性检测实验
检测对象分别是黑尾叶蝴Nepho te t tix cinc ticeps、褐飞虱NiLaparva ta Lugens(BPH)和白背飞虱SogateLLa furvifera Horvath (WBPH)的卵、各龄若虫、雄成虫、雌成虫及稻田其它常见昆虫及天敌:二化螟ChiLo suppressaLi s\三化螟TryporyzaincertuLasx 电光叶蝴 ReciLia dorsalis；摇蚊 Chironomidae.,灰撤榄长角跳虫Entomobrya《riseooZiFaia;拟水狼蛛 Pirata食虫瘤胸蛛 UmmeLita
/aseciice/75.;猫蛛 Oxyopidae ;维腹肖銷 Tetragnatha ?ariZZ1sa;鲍哈莫蛛 Harmochirusbrachiatus\ 黑肩绿盲畴 Cytorrhinus Lividipennis' 蟹蛛 Thomisus ；八斑鞘腹蛛Theridonn octomacutatum Boes ;灰飞風 LaodeLphax stria乙e/Zws;拟环纹豹蛛 Pardosa等，将上述抗原用包被液稀释至0.05g/L后包被酶标板。以包被液为空白对照，用间接ELISA法检测抗体的特异性，其中抗体的稀释倍数为1:20000，酶标二抗的稀释倍数为1:3000。经上述检测该抗体和上述昆虫及捕食性天敌的抗原不发生交叉反应，但该抗体与黑尾叶蝉抗原反应强烈，可以明显判别是否存在黑尾叶蝉抗原。
[0020]实施例4
该单克隆抗体的灵敏度检测实验
采用间接ELISA方法测定单克隆抗体的灵敏度。将黑尾叶蝉抗原用包被液倍比稀释为1:50X2°?I:50X2 8，包被在酶标板上，浓度由左到右从高到低。重复8次，第11列为空白对照，仅用包被液包被。单克隆抗体的稀释倍数为1:20000，酶标二抗的稀释倍数为1:3000。通过检测得黑尾叶蝉抗原的最大稀释倍数为1600倍，即检测灵敏度为0.05g/mL-r-1600=31.25 μ g/mL。
[0021]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种杂交瘤，其特征在于:该杂交瘤为杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241。
2.—种单克隆抗体，其特征在于:该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No:C2014241分泌的单克隆抗体。
3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于所述杂交瘤细胞NC-4D12由下述方法制备得到:用抗原蛋白免疫BaL b/c小鼠，然后BaL b/c小鼠脾细胞与SP 2/0细胞在50%聚乙二醇作用下进行融合，融合后进行HAT培养，然后吸取杂交瘤细胞培养上清液进行ELISA检测，筛选出阳性且不与稻田其他昆虫和蜘蛛的抗原发生反应的细胞株，用有限稀释法克隆至能稳定分泌单克隆抗体的细胞株NC-4D12，即获得单克隆抗体杂交瘤细胞；其中，所述抗原蛋白来自研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清液。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述抗原蛋白免疫BaLb/c小鼠的具体步骤为:选取10?12周龄的健康BaL b/c小鼠3只，采用腹腔注射法，每只注射用等量福氏完全佐剂乳化的抗原200 μ L ；3周后免疫使用等量福氏不完全佐剂乳化抗原200 μ L ；再过3周后用不加佐剂的抗原免疫。
5.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述融合具体为:最后一次免疫后3天，收集抗血清，在无菌条件下取小鼠脾淋巴细胞用于细胞融合；采用聚乙二醇作融合剂，小鼠骨髓瘤细胞系为SP 2/0，整个过程在无菌条件下操作，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞放入50mL离心管中，混合离心后，吸尽上清液，弹匀细胞；将离心管置于37°C水浴预温的盛水烧杯中，在Imin内加入50%PEG 0.7mL，静止Imin后，逐渐加入已经预温至37°C的RMP1-1640培养基40mL，使PEG稀释而失去作用，离心后弃上清液。
6.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于所述HAT培养具体为:将沉淀的细胞悬于40mL HAT培养基后，分装于事先加有饲养细胞的96孔细胞培养板中，置于5%0)2温箱中在37°C下培养；3天后换一半HAT培养基，5天后再换一半HAT培养基，再5天改用HT培养基继续培养。
7.保藏编号CCTCCNo:C2014241的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体用于识别黑尾叶蝉的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种杂交瘤、单克隆抗体及其用途，该杂交瘤为杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：C2014241，该抗体是由杂交瘤细胞NC-4D12 CCTCC No：C2014241分泌的单克隆抗体。本发明抗体是将研磨黑尾叶蝉虫体所得的上清作为免疫原，利用单克隆抗体制备技术获得的针对黑尾叶蝉特异的单克隆抗体；该抗体被用于黑尾叶蝉的鉴定、动态监测以及研究捕食性天敌对其的控制作用；本发明通过BaL b/c小鼠腹腔注射单抗细胞株，即可获得大量的该单克隆抗体，与多克隆抗体相比，具有纯度高，专一性强，重复性好等优点。CCTCC NO：C201424120141217
【IPC分类】C07K16-18, C12N5-20, C12R1-91, G01N33-577
【公开号】CN104789534
【申请号】CN201510167846
【发明人】赵伟春, 徐艳山, 王丹依
【申请人】浙江中医药大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月10日