一种自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法及其试剂盒产品的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的方法，其中包括如下特征：其 中包括如下特征：来自于癌症患者自身的外周血单个核细胞，在重组人白介素15、重组人 白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关 分子A共同作用下激活自然杀伤细胞增殖，并增强自然杀伤细胞杀伤潜能；本发明还提供 了一种含通过上述方法而得到的自体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的试剂盒，可在体外大量 增殖获得自然杀伤细胞并具有杀伤活性，可用于各类癌症包括实体瘤和血液肿瘤在内的多 个疗程的免疫治疗。
【背景技术】
[0002] 自然杀伤细胞（Natural Killer cells，NK)主要表达CD16+/CD56+表型，是先天 性免疫系统的重要组成部分，是机体抗感染免疫、抗肿瘤免疫及清除非己细胞的第一道防 线。与T淋巴细胞不同，NK细胞无需肿瘤特异性抗原识别便可以直接杀伤肿瘤细胞和病毒 感染的细胞。NK细胞功能的发挥由其细胞表面活化性受体和抑制性受体所传递的信号共同 决定，但在癌症患者体内肿瘤细胞通过机体炎症分子抑制NK细胞表面活化性受体表达，表 达抑制性受体从而逃避NK细胞杀伤。因而，激活NK细胞高表达活化性受体而活化其杀伤 活性就至关重要了，NK细胞对黑素瘤、肺癌、肾癌、结肠癌、乳腺癌、膀胱癌、肝癌和白血病等 肿瘤治疗有明显疗效。
[0003] NK细胞数量和杀伤功能与疗效直接相关，治疗中存在的问题在于获得大量NK细 胞有限和培养时间过长。传统使用的白介素2激活生长倍数有限，端粒长度缩短，培养时间 过长引起了 NK细胞杀伤功能低下。目前，临床治疗用的NK细胞培养技术也有采用基因工 程化和病毒转染的滋养细胞与NK细胞共培养后，激活NK细胞增殖和活化其杀伤功能。
[0004] 本发明提供了 NK细胞鸡尾酒式培养方法，即在含有重组人白介素15、重组人白介 素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分 子A共同作用下大量扩增NK细胞，30ml外周血来源单个核细胞培养至21天细胞增殖到 30 X 109以上，增殖倍数达到1000倍以上，NK细胞杀瘤活性在14-16天达到最佳，培养过程 中不需要基因工程化的滋养层细胞，简单快速，为患者临床治疗大大节约了时间，并发挥出 最好的抗肿瘤作用，有助于提高临床疗效和延长患者生存期，而且可以大大降低细胞培养 成本。
【发明内容】
[0005] 本发明针对能更好地从癌症患者自体的单个核细胞扩增获得NK细胞，逆转患者 体内NK细胞免疫抑制而增强其杀伤活性。本发明通过前期研宄实验发现鸡尾酒式培养方 法，即在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人白介素21、重组人白介素12、重组 人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以上细胞因子共同作用下诱导激活产 生NK细胞，培养至21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，所述NK细胞经流式细胞仪检测后 ⑶56+/⑶16+表型均大于80%，⑶3+细胞低于10%，并具有很强杀伤活性。
[0006] NK细胞发育依赖于白介素15(Interleukin-15, IL-15)，并促使组织中休眠的NK 细胞达到效应阶段，具有促进淋巴细胞和NK细胞增殖和增强它们生物活性的功能；IL-18、 IL-21、IL-12、IL-7和MHC-I类链相关分子A是与其受体结合后可以显著诱导了 NK细胞的 产生，调节NK细胞的增殖、分化并能提高NK细胞杀伤活性对肿瘤完全排斥，这些细胞因子 联合作用对活化前的NK细胞功能是有效的诱导剂，并协同IL-15促进骨髓前体细胞增殖和 NK细胞增殖、分化和细胞毒活性，使其能杀死NK敏感的和NK抗性的肿瘤细胞。本发明通过 发挥这些细胞因子的协同作用机制，激活NK细胞增殖和增强其杀伤活性，抑制NK细胞中调 节性T淋巴细胞的增殖和产生，延长NK细胞端粒酶活性，可产生对肿瘤细胞最佳的杀伤活 性。
[0007] 本发明涉及体自然杀伤细胞鸡尾酒式培养的制备方法，其中包括如下特征：来自 于癌症患者30ml外周血的单个核细胞，在含有重组人白介素15、重组人白介素18、重组人 白介素21、重组人白介素12、重组人白介素7以及重组人MHC-I类链相关分子A中三种以 上细胞因子（优选同时含有上述细胞因子）共同作用下激活自然杀伤细胞大量增殖，培养 到21天细胞增殖倍数达到1000倍以上，并增强自然杀伤细胞的杀伤活性。
[0008] 本发明所述的鸡尾酒式培养体系，为细胞培养基中含有lng-500ng/ml重组人白 介素15、lng_500ng/ml重组人白介素18、lng_500ng/ml重组人白介素21、lng_500ng/ml重 组人白介素12、lng-500ng/ml重组人白介素7以及lng-500ng/ml重组人MHC-I类链相关分 子A中三种以上细胞因子。鸡尾酒式培养体系优选为细胞培养基中含有10ng-50ng/ml重组 人白介素15、10ng_50ng/ml重组人白介素18、10ng_50ng/ml重组人白介素21、10ng_50ng/ ml重组人白介素12、10ng-50ng/ml重组人白介素7以及10ng-50ng/ml重组人MHC-I类链 相关分子A中三种以上细胞因子。
[0009] 本发明所述制备自体杀伤细胞鸡尾酒式培养方法为：采集癌症患者30ml外周血， 经淋巴细胞分离液密度梯度离心获得单个核细胞，将其在32ml的细胞培养基（含有5%自 体血衆、50ng/ml重组人白介素15、20ng/ml重组人白介素18、20ng/ml重组人白介素21、 20ng/ml重组人白介素12、20ng/ml重组人白介素7和50ng/ml重组人MHC-I类链相关分子 A中三种以上细胞因子）中，加入到细胞培养板中，在37°C、5% C02培养箱中继续培养5天 以上。
[0010] 鸡尾酒式激活培养5天后，将自然杀伤细胞用5mL移液管吹打后，吸取至新的细胞 培养瓶中，并补充10_20mL新鲜细胞培养基（含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在 37°C、5% C02培养箱中继续培养2-3天；将NK细胞转移到细胞培养袋中，并继续补充一倍 体积的新鲜细胞培养基（含50-500活性单位/mL重组人白介素2)，在37 °C、5 % C02培养箱 中继续培养2-3天；然后自然杀伤细胞连续增殖培养到21天，使得细胞数达到30X 109以 上。
[0011] 所述鸡尾酒式培养试剂，优选地，外周血单个核细胞在24孔细胞培养板、12孔细 胞培养板或6孔细胞培养板中连续培养5天以上，诱导激活NK细胞。
[0012]自然杀伤细胞优选地，来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新 鲜外周血。NK细胞临床治疗中采取1个疗程4-8次的回输治疗，即每周采集外周血1次，应 用于1次NK细胞的回输，共完成1个疗程的4-8次的治疗。
[0013] 本发明使用的细胞培养基为淋巴细胞无血清培养基或RPMI 1640培养基加入 50-500活性单位/mL重组人白介素2和10% (体积比）自体血清或胎牛血清，优选地，细胞 培养基为淋巴细胞无血清培养基，如 RPMI1640、CellGro@SCGM、Tex?MACS、K0HJIN@GT-T502、 X-VIVO和GT-H551等，含有500活性单位/mL重组人白介素2，该低浓度白介素2可促进NK 细胞的增殖，维持NK细胞长期生长。
[0014] 本发明还提供了鸡尾酒式制备自体自然杀伤细胞的试剂盒，其特征在于，所述试 剂盒包括：
[0015] (1) 200ml淋巴细胞分离液；
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