专利名称：产生自然杀伤细胞的方法
技术领域：
本文提供了产生自然杀伤细胞群体的方法，例如，来源于胎盘的自然杀伤细胞，例如，来源于胎盘灌洗液(例如，人胎盘灌洗液)，如胎盘源中间体自然杀伤细胞，或者来源于其他组织，例如，脐带血或外周血。本文还提供了通过本文所提供的方法产生的扩增的自然杀伤细胞群体。本文还提供了使用胎盘灌洗液以及来自所述胎盘灌洗液的自然杀伤细胞抑制肿瘤细胞增殖的方法。在某些实施方式中，将所述自然杀伤细胞与一种或多种免疫调节化合物(例如，称为IMiD 的免疫调节化合物)组合使用或用所述一种或多种免疫调节化合物处理。
3.
背景技术：
自然杀伤(NK)细胞是构成天然免疫系统的主要部分的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞不表达T细胞抗原受体(TCR)、CD3或表面免疫球蛋白(Ig) B细胞受体。NK细胞通常在人中表达表面标志物⑶16 (FcyRIII)和⑶56，但人NK细胞的亚类为⑶16。NK细胞是细胞毒性的；它们细胞质中的微粒含有特殊的蛋白质，如穿孔素和被称为颗粒酶的蛋白酶。一旦在要杀伤的靶细胞附近释放，则穿孔素在所述靶细胞的细胞膜中形成孔，通过该孔颗粒酶和结合分子可以进入，从而引起细胞凋亡。一种颗粒酶，颗粒酶B (也称为颗粒酶2和细胞毒性T-淋巴细胞相关丝氨酸酯酶1)，是对于在细胞介导免疫反应中快速引起靶细胞细胞凋亡来说至关重要的丝氨酸蛋白酶。NK细胞对干扰素或者巨噬细胞源细胞因子响应而被激活。激活的NK细胞称为淋巴因子活化的杀伤(LAK)细胞。NK细胞具有控制细胞的细胞毒活性的两种表面受体类型(标记为“激活受体”和“抑制受体”)。除了活性，NK细胞在宿主肿瘤排斥中起作用。由于癌细胞的I类MHC表达降低或无表达，因此它们可以成为NK细胞的靶标。积累的临床数据表明分离自外周血单核细胞(PBMC)或骨髓的人NK细胞的单倍同一性移植介导了有效力的抗白血病作用而不会导致可检测的移植物抗宿主病(GVHD)。参见Ruggeri等人，Science295:2097-2100 (2002)。自然杀伤细胞可以通过细胞缺少或显示出降低水平的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白而被激活。另外，已知NK细胞上表达的激活受体介导了具有激活受体表达配体的“应激”或转化细胞的检测，并因此引起了 NK细胞的激活。例如，NCRl (NKp46)结合病毒血球凝集素。NKG2D配体包含CMV UL16结合蛋白I (ULB1 )、ULB2，ULB3和MHC I类多肽相关序列A(MICA)和MICB蛋白。NK蛋白2B4结合⑶48，并且DNAM-1结合脊髓灰质炎病毒受体(PVR)和连接素2 (Nectin-2)，两者均在急性骨髓性白血病(AML)中持续检测到。参见Penda等人，Bloodl05:2066-2073 (2004)。参见Marrobio等，此外，已说明AML的溶胞主要是自然细胞毒性受体(NCR)依赖性的。参见Fauriat等人，Bloodl09:323-330 (2007)。激活并扩增的来源于外周血的NK细胞和LAK细胞已在晚期癌患者的离体疗法和体内治疗中使用，并且对骨髓相关疾病，如白血病；乳腺癌；和某些类型的淋巴瘤取得了一定的成功。LAK细胞治疗需要患者首先接受IL-2，随后进行白细胞去除术，然后将收获的自体同源性血细胞在存在IL-2的情况下培育和培养几天。必须将LAK细胞与相对高剂量的IL-2 —起再输注以完成所述疗法。这种净化治疗(purging treatment)是昂贵的并可以导致严重的副作用。这些包括体液潴留、肺水肿、血压降低和高烧。虽然NK细胞在杀死肿瘤细胞和病毒感染细胞中具有有利性能，但是它们仍难以与免疫疗法一起使用和在免疫疗法中应用，这主要是由于在培养和扩增期间难以维持它们的肿瘤靶向和杀肿瘤能力。因此，在本领域中需要发展产生和扩增保留杀肿瘤功能的自然杀伤细胞的有效方法。
4.
发明内容
本文提供了将细胞，例如，造血细胞，如造血干细胞，例如，⑶34+造血干细胞，扩增和分化为自然杀伤细胞的方法。在一个方面，本文提供了产生自然杀伤(NK)细胞的方法，包括在第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+干细胞或祖细胞以产生扩增和分化的细胞，并随后在其中所述细胞进一步扩增并分化成自然杀伤细胞的第二培养基中培养所述扩增的细胞。该第一步骤和第二步骤包括在具有细胞因子独特组合的培养基中培养细胞。在某些实施方式中，所述细胞因子(例如，细胞因子)不包含在培养基不明确的组分(例如，血清)中，例如，细胞因子(例如，细胞因子)对于培养基不明确的组分(例如，血清)来说是外源的。在某些实施方式中，所述方法是两步法。在某些实施方式中，该方法不包括其中接触细胞的任何第三步骤或中间步骤。在具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的方法，其包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和(b)将来自第一步骤的细胞在包含白细胞介素-2( IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。通过本文所提供的方法(例如，两步法)产生的自然杀伤细胞在本文中被称为TSNK细胞。在某些实施方式中，所述第一培养基包括含有人血清(例如，人血清AB)、胎牛血清(FBS)或胎牛血清(FCS)，例如，5%至20%(v/v);干细胞因子(SCF)，例如，Ing/mL至50ng/mL ；FMS样酪氨酸激酶_3配体(Flt-3配体)，例如，Ing/mL至20ng/mL ;白细胞介素_7 (IL-7)，例如，Ing/mL至50ng/mL ;促血小板生成素(ΤΡ0),例如，Ing/mL与50ng/mL ;白细胞介素_2(IL-2)，例如，50IU/mL 至 500IU/mL ;白细胞介素-15 (IL-15)，例如，Ing/mL 至 50ng/mL ;和/或肝素，例如，0.lIU/mL至10IU/mL中一种或多种的培养基。在具体的实施方式中，所述第一培养基包含干细胞因子(SCF)、白细胞介素-7 (IL-7)和白细胞介素-15 (IL-15)。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、人血清(例如，人血清AB)、FBS、FCS、SCF、IL-7和IL-15。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基还包含Flt_3配体(Flt3-L)、TPO、IL-2和/或肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基包含生长培养基、10%的人血清或者胎牛血清、20ng/mL的SCF、10ng/mL的Flt3_L、20ng/mL的IL-7、20ng/mL 的 TP0、200IU/mL 的 IL_2、10ng/mL 的 IL-15 和 1.5IU/mL 的肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基不包含IL-2。在另一种具体的实施方式中，在所述第一培养基中的所述培养包括使用饲养细胞，例如，K562细胞，例如，丝裂霉素C处理的K562细胞；夕卜周血单核细胞(PBMC)，例如，丝裂霉素C处理的PBMC或者组织培养贴壁干细胞，例如，丝裂霉素C处理的组织培养贴壁干细胞的培养。在某些实施方式中，所述第一培养基为或者包含GBGM 、A1M-V 、X-VIV0 10, X-VIVOtmI5, OPTMIZER、 STEMSPAN H3000、CELLGRO、COMPLETE 和 /或DMEM:F12。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰卡尼汀(还称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或0AC)，例如，约0.5mM-10mM。在一种实施方式中，所述培养基包括Stemspan H3000 和 / 或 DMEM:F12 和 0AC，例如，约 0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9 或 10mM。在具体的实施方式中，所述培养基包含GBGM ;.在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM:F12和约5mM的0AC。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含Stemspan H3000 和约 5mM 的 OAC。 在某些实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含人血清(例如，人血清AB)、胎牛血清(FBS)或者胎牛血清(FCS)，例如，5%-15%的FCS (v/v) ;IL_2，例如，10IU/mL至1000IU/mL ;转铁蛋白,例如，10 μ g/mL与50 μ g/mL ;胰岛素，例如，5 μ g/mL至20 μ g/mL ；乙醇胺，例如,5X IO4至5X IO5M ;油酸，例如,0.1 μ g/mL至5 μ g/mL ;亚油酸,例如，0.1 μ g/mL至5μ g/mL ;棕榈酸,例如,0.05 μ g/mL至2μ g/mL ;牛血清白蛋白(BSA),例如，I μ g/mL至5 μ g/mL ;和/或植物凝集素,例如,0.01 μ g/mL至I μ g/mL中的一种或多种。在具体的实施方式中，所述第二培养基包含IL-2。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含细胞生长培养基，其包含人血清、FBS或FCS (例如，10% (v/v))、IL-2、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(BSA)和/或植物凝集素。在更具体的实施方式中，所述第二培养基包含伊思考夫改良杜尔贝可培养基(MDM)、10%的人血清、FBS或者FCS、400IU的IL_2、35 μ g/mL的转铁蛋白、5 μ g/mL的胰岛素、2X ICT5M的乙醇胺、I μ g/mL 的油酸、I μ g/ mL 的亚油酸、0.2 μ g/mL 的棕榈酸、2.5 μ g/mL 的 BSA 和 0.1 μ g/mL的植物凝集素。在另一种具体的实施方式中，在所述第二培养基中的所述培养包括(例如)当细胞在所述第二培养基中起始时，此后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10天时，使用饲养细胞，例如，K562细胞(例如，丝裂霉素C处理的K562细胞)或PBMC (例如，丝裂霉素C处理的PBMC)的培养。在某些实施方式中，所述培养基包含GBGM 、A丨M-V 、X-VIV0TM10、X-VIV0 、OPTMIZER、STEMSPAN ] H3000、CELLGRO COMPLETE 和 / 或 DMEM:F12。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰卡尼汀(也称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或0AC)或影响线粒体中乙酰辅酶A循环的化合物、N-苄基_2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺(thiazovivin)、Y_27632、pyintegrin、P激酶(ROCK)抑制剂、半胱天冬氨酸酶抑制剂或其他抗凋亡化合物/肽、NOVA-RS (Sheffield Bio-Science)或其他小分子生长增强因子中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含烟酰胺。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mM-10mM OAC0在一种实施方式中，所述培养基包括Stemspan H3000和/或DMEM:F12和0AC，例如，约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。在具体的实施方式中，所述培养基包含GBGM 在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM: Fl2和约5mM的OACo在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含Stemspan H3000和约5mM的0AC。在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的方法，包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和6)将来自步骤(a)的细胞在包含白细胞介素_2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。在另一种具体的实施方式中，本文提供了产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的两步法，其中所述方法的第一步包括在包含SCF、IL-7和IL-15中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分(例如，血清)中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中该方法的第二步包括在包含IL-2的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞，以产生激活的NK细胞。在另一种具体的实施方式中，该第一培养基还包含Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、促血小板生成素(Τρο)、白细胞介素-2 (IL-2)和/或肝素中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，该第一培养基还包含约5%-20%的胎牛血清或人血清。在另一种具体的实施方式中，所述SCF在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述Flt3_L在所述第一培养基中以约I至约150 ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-2在所述第一培养基中以约50至约1500IU/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-7在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述IL-15在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述Tpo在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述肝素在所述第一培养基中以约0.1至约30U/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述第二步中的所述IL-2在所述第二培养基中以50至约1500IU/mL的浓度存在。在另一种具体的实施方式中，所述第二培养基另外包含胎牛血清(FCS)、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(BSA)和植物凝集素中的一种或多种。在某些具体的实施方式中，在所述第二培养基中进行所述培养前将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在某些其他的具体实施方式
中，将所述细胞在所述第二培养基中培养 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天。在更具体的实施方式中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养21天，然后在所述第二培养基中培养21天。本文还提供了通过如上所述的两步法产生的自然杀伤细胞群体，其在本文中称为TSNK细胞。在具体的实施方式中，所述NK细胞(例如，TSNK细胞)是CD3—CD56+。在具体的实施方式中，所述NK细胞(例如，TSNK细胞)是⑶3TD56+CD16—。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞(例如，TSNK细胞)另外是⑶94—CD117+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞(例如，TSNK细胞)另外是CD161_。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞(例如，TSNK细胞)另外是NKG2D+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是NKp46+。在另一种具体的实施方式中，所述NK细胞另外是CD226+。在某些实施方式中，大于90%、92%、94%、96%或98%的所述TSNK细胞为CD56+和CD16'在一些实施方式中，至少80%、82%、84%、86%、88%或90%的所述TSNK细胞为CD:T和CD56+。在其他实施方式中，大于90%、92%、94%、96%或98%的所述TSNK细胞是CD56+、CD16l口CD3'在其他实施方式中，至少50%、52%、54%、56%、58%或60%的所述TSNK细胞是NKG2D+。在其他实施方式中，少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%的所述TSNK细胞是NKB1+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是NKAT2+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16+。在更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%或70%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为NKp46+。在其他更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD117+。在其他更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%、40%或45%的所述CD3'CD56+TSNK细胞为CD94+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或50%的所述⑶3'⑶56+TSNK细胞为⑶16Γ。在其他更具体的实施方式中，至少10%、12%、14%、16%、18%或20%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD226+。在更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%或40%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD7+。在更具体的实施方式中，至少 30%、35%、40%、45%、50%、55% 或 60% 的所述 CD3' CD56+TSNK 细胞为 CD5+。在另一个方面，本文提供了 TSNK细胞抑制肿瘤细胞增殖，治疗病毒感染或治疗癌(例如，血癌和实体瘤)的使用。在某些实施方式中，TSNK细胞与免疫调节化合物接触或与免疫调节化合物组合使用，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺。
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在具体的实施方式中，所述癌是实体瘤。在另一种实施方式中，所述癌是血癌。在具体的实施方式中，所述癌是成胶质细胞瘤、原发性导管癌、白血病、急性T细胞白血病、慢性脊髓淋巴瘤(CML)、急性髓性白血病(AML)、慢性粒细胞性白血病(CML)、肺癌、结肠腺癌、组织细胞淋巴瘤、结直肠癌、结直肠腺癌、前列腺癌、多发性骨髓瘤或视网膜母细胞瘤。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞来自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，是来自胎盘灌洗液和脐带血(例如，来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的混合细胞。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，可以通过混合或合并脐带血和胎盘灌洗液来获得混合的细胞。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以 100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或者3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。在更具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85%: 15%)的比例混合。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1: 35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100 等的总有核细胞(TNC)含量的比值混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10: 1、5:1至1:5或者3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。因此，在一种实施方式中，本文提供了治疗患有癌或病毒感染的个体的方法，包括向所述个体施用有效量的分离的TSNK细胞。在具体的实施方式中，在所述施用之前，已用免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺处理了所述分离的TSNK细胞。在另一种具体的实施方式中，所述方法包括向所述个体施用(I)有效量的分离的TSNK细胞；和(2)有效量的免疫调节化合物或者沙利度胺。在本文中，“有效量”是指与患有所述癌或所述感染但未施用所述TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的个体相比导致所述癌或所述感染的一种或多种症状的可检测的改善的TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在具体的实施方式中，所述免疫调节化合物是来那度胺或玻马利度胺(pomalidomide)。在另一种实施方式中，所述方法还包括向所述个体施用抗癌化合物，例如，以下6.8.3节中所述的抗癌化合物的一种或多种。在另一种实施方式 中，本文提供了抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括用治疗有效量的TSNK细胞接触肿瘤细胞。在具体的实施方式中，在所述接触之前，已用免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺处理了所述分离的TSNK细胞。在另一种具体的实施方式中，另外用有效量的免疫调节化合物，例如，下文中6.2.1节中所述的免疫调节化合物或沙利度胺接触所述肿瘤细胞。在本文中，“有效量”是指与未与所述TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺接触的相等个数的肿瘤细胞相比，导致所述肿瘤细胞可检测的抑制的TSNK细胞和可选的免疫调节化合物或沙利度胺的量。在另一种具体的实施方式中，所述方法还包括用有效量的抗癌化合物，例如，下文中6.8.3节中所述的抗癌化合物接触所述肿瘤细胞。在本方法的具体实施方式
中，所述肿瘤细胞是血癌细胞。在另一种具体的实施方式中，所述肿瘤细胞是实体瘤细胞。在另一种实施方式中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性脊髓淋巴瘤(CML)细胞、急性髓性白血病细胞、慢性粒细胞性白血病(CML)细胞、成胶质细胞瘤细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、视网膜母细胞瘤细胞、结直肠癌细胞、前列腺癌细胞或结直肠腺癌细胞。在另一种具体的实施方式中，所述接触是在体外进行的。在另一种具体的实施方式中，所述接触是在体内进行的。在更具体的实施方式中，所述体内接触是在人中进行的。在另一个方面，本文提供了治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括向所述个体施用(I)来那度胺；(2)美法仑；和(3)扩增的NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的多发性骨髓瘤来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血细胞产生的NK细胞，例如，造血干细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞(例如，用于产生TSNK细胞)的任何方法产生了所述NK细胞。在另一种实施方式中，在所述施用之前已扩增了所述NK细胞。在另一种实施方式中，所述来那度胺、美法仑和/或NK细胞是彼此单独施用的。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施方式
中，所述NK细胞是通过产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的两步法产生的，其中所述方法的第一步包括在包含干细胞因子(SCF)、白细胞介素-7 (IL-7)和白细胞介素-15 (IL-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中所述方法的第二步包括在包含白细胞介素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞以产生激活的NK细胞。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的其他的具体实施方式
中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞jP(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白细胞介素_2(IL-2)的第二培养基中扩增以产生激活的NK细胞群体。在另一个方面，本文提供了治疗患有慢性淋巴细胞性白血病(CLL)的个体的方法，包括向所述个体施用治疗有效量的(I)来那度胺；(2)美法仑；(3)氟达拉滨；和(4)扩增的NK细胞(例如，TSNK细胞)，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的所述CLL来说是有效的。在具体的实施方式中，所述NK细胞是脐带血NK细胞，或由脐带血造血细胞产生的NK细胞，例如，造血干细胞。在另一种实施方式中，已通过本文所述的用于产生NK细胞(例如，用于产生TSNK细胞)的任何方法产生了所述NK细胞。在任何上述方法的具体实施方式
中，在所述施用之前已将所述NK细胞扩增了至少10天。在任何上述方法的具体实施方式
中，将所述来那度胺、美法仑、氟达拉滨和扩增的NK细胞单独施用给所述个体。在治疗患有CLL的个体的方法的某些具体实施方式
中，所述NK细胞是通过产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的两步法产生的，其中所述方法的第一步包括在包含干细胞因子(SCF)、白细胞介素-7 (IL-7)和白细胞介素-15 (IL-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和其中所述方法的第二步包括在包含白细胞介素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞以产生激活的NK细胞。
在治疗患有CLL的个体的方法的其他的具体实施方式
中，所述NK细胞是通过以下方法产生的，所述方法包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15(IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素_7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞jP(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白细胞介素_2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。在一个方面，本文提供了冷冻保存NK细胞(例如，TSNK细胞)群体的方法。在一种实施方式中，所述方法包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15(IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞jP(b)将来自步骤(a)的细胞在包含白细胞介素_2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体，和(c)将来自步骤(b)的NK细胞在冷冻保存培养基中冷冻保存。在具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(I)制备细胞悬液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步 骤(I)的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和(4)在-80°C以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)以及步骤(b)和(c)之间不包括中间步骤。在另一种实施方式中，冷冻保存NK细胞(例如，TSNK细胞)群体的所述方法包括:Ca)将造血干细胞或祖细胞群体在包含干细胞因子(SCF)、IL-2、白细胞介素_7 (IL-7)、白细胞介素-15 (IL-15)和肝素中的一种或多种的第一培养基中扩增，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；(b)在包含白细胞介素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增来自步骤(a)的细胞以产生激活的NK细胞，和(c)在冷冻保存培养基中冷冻保存得自步骤(b)的NK细胞。在具体的实施方式中，所述步骤(c)还包括(I)制备细胞悬液；(2)将冷冻保存培养基加入到来自步骤(I)的细胞悬液中以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)将来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液冷却以获得冷冻保存样品；和(4)在-80°C以下储存所述冷冻保存样品。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)以及步骤(b)和(c)之间不包含中间步骤，和/或在步骤(a)之前不包含其他培养步骤。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，从中产生TSNK细胞的造血干细胞或祖细胞)以比外周血自然杀伤细胞可检测更高的水平表达微小RNA hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517, hsa_miR-518c, hsa_miR-519b 和 hsa_miR-520a 中的一种或多种，如(例如)通过定量实时PCR CqRT-PCR)所确定的。在上述方法的另一种具体实施方式
中，所述TSNK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述自然杀伤细胞比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，TSNK细胞)表达可检测更多的颗粒酶B或穿孔素的量和时间接触。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述细胞比未接触所述免疫调节化合物(例如，来那度胺或者玻马利度胺(pomalidomide ))或沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，TSNK细胞)对所述肿瘤细胞表现出可检测更强的细胞毒性的量和时间接触。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞以比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，TSNK细胞)更高的水平表达BAX、CCL5、CCR5、CSF2、FAS、⑶SB、IL2RA或TNFRSF18中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞以比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(例如，TSNK细胞)更高的水平表达ACTB、BAX、CCL2、CCL3、CCL5、CCR5、CSF1、CSF2、ECEl、FAS、GNLY,⑶SB、GZMB, ILIA、IL2RA、IL8、IL10、LTA, PRF1、PTGS2、SKI 和 / 或TBX21中的一种或多种。在上述治疗法或肿瘤抑制法的某些实施方式中，TSNK细胞与其他自然杀伤细胞混合，例如，分离自胎盘灌洗液、脐带血或外周血的自然杀伤细胞或者通过不同的方法由造血细胞产生的自然杀伤细胞。在具体的实施方式中，所述TSNK细胞与来自另一种来源或通过不同的方法制备的自然杀伤细胞以 100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100 等的比值混合。在另一个方面，本文提供了包含分离的TSNK细胞的组合物。在具体的实施方式中，所述TSNK细胞是由造血细胞产生的，例如，分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞占所述组合物中至少50%的细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞占所述组合物中至少80%、85%、90%、95%、98%或99%的细胞。在某些实施方式中，所述组合物中大于90%、92%、94%、96%或98%的TSNK细胞是CD56+和CD16'在其他实施方式中，所述组合物中至少80%、82%、84%、86%、88%或90%的TSNK细胞是CD:T和CD56+。在其他实施方式中，至少50%、52%、54%、56%、58%或60%的所述细胞是NKG2D+。在 其他实施方式中，少于10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%或3%的所述细胞是NKB1+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述细胞是NKAT2+。在某些其他实施方式中，少于10%、8%、6%、4%或2%的所述TSNK细胞是CD56+和CD16+。在更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%或70%的所述CD3'CD56+TSNK细胞为NKp46+。在其他更具体的实施方式中，至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%的所述CD3'CD56+TSNK细胞为CD117+。在其他更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%、40%或45%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD94+。在其他更具体的实施方式中，至少10%、12%、14%、16%、18%或20%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD226+。在更具体的实施方式中，至少20%、25%、30%、35%或40%的所述CD3' CD56+TSNK细胞为CD7+。在更具体的实施方式中，至少 30%、35%、40%、45%、50%、55% 或 60% 的所述 CD3' CD56+TSNK 细胞为 CD5+。在另一种具体的实施方式中，所述分离的⑶56+、⑶16_TSNK细胞来自单一个体。在更具体的实施方式中，所述分离的CD56+、CD16—自然杀伤细胞包括来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一种具体的实施方式中，所述TSNK细胞已与免疫调节化合物或沙利度胺以足以使所述TSNK细胞比未接触所述免疫调节化合物或者沙利度胺的相等个数的自然杀伤细胞(即，TSNK细胞)表达可检测更多的颗粒酶B或穿孔素的量和时间接触。在另一种个具体的实施方式中，所述组合物另外包含免疫调节化合物或者沙利度胺。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是下文中6.2.1节中所述的化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。在更具体的实施方式中，所述组合物包含来自另一种来源或通过另一种方法制备的TSNK细胞和自然杀伤细胞。在具体的实施方式中，所述其他来源是胎盘血和/或脐带血。在另一种具体的实施方式中，所述其他来源是外周血。在更具体的实施方式中，所述TSNK细胞与来自另一种来源或通过另一种方法制备的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比值混合。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含TSNK细胞和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞中的任一种。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液来源于和所述TSNK细胞相同的个体。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来源于和所述TSNK细胞不同的个体的胎盘灌洗液。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中所有或基本上所有(例如，大于90%、95%、98%或者99%)的细胞是胎儿细胞。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿细胞和母细胞。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液中的胎儿细胞占所述灌洗液中小于约90%、80%，70%,60%或者50%的细胞。在另一种具体的实施方式中，通过将0.9%NaCl溶液通过胎盘脉管系统获得所述灌洗液。在另一种具体的实施方式中，所述灌洗液包含培养基。在另一种具体的实施方式中，已处理了所述灌洗液以除去红血球。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如，下文中5.2.1.1节中`所述的免疫调节化合物，例如，氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。在另一种个具体的实施方式中，所述组合物包含TSNK细胞和胎盘灌洗液细胞。在更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞来源于和所述TSNK细胞相同的个体。在另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液细胞来源于和所述TSNK细胞不同的个体。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞来源于不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方式的另一种更具体的实施方式中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方式的另一种更具体的实施方式中，所述分离的胎盘灌洗液细胞来源于至少两个个体。在另一种具体的实施方式中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一种具体的实施方式中，所述组合物另外包含一种或多种抗癌化合物，例如，下文中6.8.2节中所述的一种或多种抗癌化合物。4.1.定义如本文所使用的，术语“免疫调节化合物”和“ MiD ”不包含沙利度胺。
如本文所使用的，“来那度胺”表示3-(4’ -氨基异吲哚-1’ -酮)-1_哌啶_2，6_ 二酮(化学文摘社命名)或者2，6-哌啶二酮，3-(4_氨基-1，3- 二氢-1-氧-2H-异吲哚-2-基)-(国际纯粹化学与应用化学联合会(IUPAC)命名)。如本文所使用的，“玻马利度胺(pomalidomide)”表示4-氨基_2_(2，6- 二氧哌唆-3-基)异口引哚-1, 3- 二酮。如本文所使用的，当表示细胞时，“多能”表示细胞具有分化成另一种细胞类型的细胞的能力。在某些实施方式中，“多能细胞”是具有生长为哺乳动物体约260种细胞类型的任何亚类的能力的细胞。与多潜能细胞不同，多能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。如本文所使用的，“饲养细胞”是指与第二类型细胞共培养以提供其中第二类型细胞可以维持并且可能增殖的环境的一种类型的细胞。不受任何理论的束缚，饲养细胞可以为靶标细胞提供(例如)肽、多肽、电信号、有机分子(例如，类固醇)、核酸分子、生长因子(例如，bFGF)、其他因子(例如，细胞因子)和代谢营养物。在某些实施方式中，饲养细胞单层生长。如本文所使用的，未进一步修饰的“自然杀伤细胞”或者“NK细胞”包括来自任何组织来源的自然杀伤细胞。如本文所使用的，“TSNK”和“TSNK细胞”表示通过本文所公开的培养/扩增方法(例如，两步法)产生的自然杀伤细胞。如本文所使用的，“胎盘灌洗液”是指已通过至少一部分胎盘(例如，人胎盘)，例如通过胎盘脉管系统的灌洗溶液，其包含在从所述胎盘中通过期间由灌洗溶液所收集的多个细胞。如本文所使用的，“胎盘灌洗液细胞”表示分离自或可分离自胎盘灌洗液的有核细胞，例如，总有核细胞。如本文所使用的，“肿瘤细胞抑制”、“肿瘤细胞增殖的抑制”等包括(例如)通过杀死所述肿瘤细胞群体中一个 或多个肿瘤细胞(例如，通过用(例如)TSNK细胞或者包含TSNK细胞的细胞群体接触肿瘤细胞群体)来减缓肿瘤细胞群体的生长。如本文所使用的，术语“造血细胞”包括造血干细胞和造血祖细胞。如本文所使用的，所述“不明确的组分”是培养基领域中的技术术语，其表示成分通常未提供或定量的组分。“不明确的组分”的实例无限制地包括人血清(例如，人血清AB)和胎儿血清(例如，胎牛血清(fetal bovine serum)或者胎牛血清(fetal calf serum))。如本文所使用的，当用于表示特定细胞标志物的存在时，“ + ”表示在对同种型对照的突光激活细胞分选中可检测地存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量RT-PCR中是在背景之上可检测的。如本文所使用的，当用于表示特定细胞标志物的存在时，表示在对同种型对照的突光激活细胞分选中可检测地不存在细胞标志物；或者细胞标志物在定量或半定量RT-PCR中是在背景之上不可检测的。
5.
图1:使用多种培养基制剂从造血干细胞(HSC)分化的NK细胞的成倍扩增。误差线代表来自三个供体的标准偏差。X轴:培养天数(D)。Y轴:与第O天(培养开始)相比的成倍扩增。
图2:用NK2A培养基培养的NK细胞的表型鉴定。用PE-抗CD56、FITC-抗CD3、PerCP-抗⑶16三重标记的细胞。水平线、垂直线:荧光标记水平显著高于背景。图3:用NK2A (FF)、NK2A (胎盘干细胞作为饲养细胞)、NK2A (MSC作为饲养细胞)或两阶段NK培养基培养的NK细胞的成倍扩增。X轴:培养天数(D)。Y轴:与第O天(培养开始)相比的成倍扩增。图4:在培养开始后第45天，用NK2A (无饲养细胞)、两阶段NK培养基；用CD34—、⑶10+、⑶105+、⑶200+组织培养贴壁胎盘干细胞(PSC)作为饲养细胞的NK2A、用骨髓源间质干细胞(MSC)作为饲养细胞的NK2A培养的NK细胞的细胞毒性。图4中显示了来源于三个供体的代表性数据。图5:在培养第41天(D41)时NK细胞的表型鉴定。显示了来源于3个单独供体的代表性数据。X轴:通过两阶段法产生的NK细胞的百分比，所述细胞是⑶3TD56+、⑶16XD56+或⑶16+⑶56+ ;或者所述细胞表达NKB1、NKG2D、NKp46、⑶94、⑶117、⑶226、⑶7或⑶5。在培养开始后的第41天，在NK2A (无饲养细胞)、两阶段NK培养基；用⑶34'⑶10+、⑶105+、⑶200+组织培养贴壁胎盘干细胞(PSC)作为饲养细胞的NK2A、用骨髓源间质干细胞(MSC)作为饲养细胞的NK2A中培养细胞。图6:NK在NK2A培养基中培养期间，⑶56+CD:TNK细胞群体中⑶94和⑶117的表达。从在NK2A培养基中培养的NK细胞中鉴别了主要的ra56+CD94+rail7+细胞群体，其与胚胎干细胞(ESC)来源的NK细胞(⑶56+⑶94+CD117ltw/-)可区分。图6中显示了来自3个供体的代表性数据。X轴:来自藻红蛋白(PE)标记的抗⑶94的荧光。Y轴:来自APC标记的抗⑶117的萤光。水平、垂直线:显著高于背景的荧光标记水平。D13、D20、D28、D35:⑶34+细胞培养开始后的第13、20、28和35天。图7:与仅有MSC和NK2A培养基相比，胎盘干细胞对培养的NK细胞的影响。X轴:在无饲养层的NK2A培养基(FF)中培养的NK细胞；在用骨髓源间质干细胞(MCS)作为饲养层的NK2A培养基中培养的NK细胞；或用CD10+、CD34-、CD105+、CD200+组织培养贴壁胎盘干细胞(PDAC)作为饲养层的NK2A培养基中培养的NK细胞。Y轴(左):细胞毒性，表示为残余的肿瘤细胞的百分比(1.0=100%);用空心正方形表示细胞毒性。Y轴(右):使用两步法的NK细胞成倍扩增；用星号表示成倍扩增。图8A-8B:脐带血(UCB)和人胎盘灌洗液(HPP)的相对比值对融化后⑶34+细胞纯度的影响。图8A =HPP体积含量(体积％)对⑶34+Lin—纯度的影响。X轴:混合的UCB和HPP(组合)中HPP的体积份数。Y轴:⑶34+Lin—细胞的百分比。图8B.HPP TNC含量(TNC%)对⑶34+Lin—纯度的影响。Y轴:⑶34+Lin—细胞的百分比。
6.
具体实施例方式本文提供了从造血细胞(例如，造血干细胞或祖细胞)产生并扩增NK细胞的新型方法。用于产生所述NK细胞的造血细胞可以分离自任何来源，例如，无限制地，胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝。在某些实施方式中，所述NK细胞是从扩增的造血细胞(例如，造血干细胞和/或造血祖细胞)产生的。在一种实施方式中，造血细胞收集自该类细胞的来源，例如，胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝和/或骨髓。在具体的实施方式中，所述造血细胞是在不使用饲养细胞的第一培养基中连续扩增和分化的。然后，将所述细胞在存在饲养细胞的第二培养基中培养。这种分离、扩展和分化可以在集中处理站中进行，其提供扩增的造血细胞以用于运输到使用地点(例如，医院、军事基地、部队前线等)进行分散扩增和分化。6.1.诰血细朐在本文所公开的方法中有用的造血细胞可以是能够分化为NK细胞的任何造血细胞，例如，前体细胞、造血祖细胞、造血干细胞等。造血细胞可以得自组织来源，如(例如)骨髓、脐带血、胎盘血、外周血、肝等或它们的组合。造血细胞可以得自胎盘。在具体的实施方式中，所述造血细胞得自胎盘灌洗液。来自胎盘灌洗液的造血细胞可以包含胎儿和母体造血细胞的混合物，例如，其中母细胞占造血细胞总数的5%以上的混合物。优选地,来自胎盘灌洗液的造血细胞包含至少约90%、95%、98%、99%或者99.5%的胎儿细胞。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，来自胎盘灌洗液、脐带血或外周血。在另一种具体的实施方式中，从中产生TSNK细胞的所述造血细胞，例如，造血干细胞或祖细胞，是来自胎盘灌洗液和脐带血(例如，得自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的混合细胞。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血分离自从中获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，可以通过混合或合并脐带血和胎盘灌洗液来获得混合的细胞。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以 100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5: 1、1: 1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5或者3:1至I的比值混合。在另一种具体的实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。在更具体的 实施方式中，将所述脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85%: 15%)的比值混合。在某些实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45:50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100 等的总有核细胞(TNC)含量的比值混合以获得所述混合的细胞。在具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5或3:1至1:3的比值混合。在另一种具体的实施方式中，所述脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比值混合。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞(例如，从中产生所述TSNK细胞的造血干细胞或祖细胞)来源于脐带血和胎盘灌洗液，但是其中所述脐带血分离自获得所述胎盘灌洗液的胎盘以外的胎盘。在某些实施方式中，所述造血细胞是CD34+细胞。在具体的实施方式中，在本文所公开的方法中有用的造血细胞是⑶34+CD38+或⑶34+⑶38_。在更具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+⑶38_Lin_。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶2_、⑶3_、⑶Ilb_、CDllc'CD14'CD16'CD19'CD24'CD56'CD66F和/或血型糖蛋白k_中的一种或多种。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶2_、⑶3_、CDllb_、CDllc_、CD14_、CD16_、⑶19_、⑶24_、⑶56_、⑶66b_和血型糖蛋白A_中的一种或多种。在另一种更具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+⑶38_CD33TD117_。在另一种更具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+CD3KCD33TDl 17XD235TD36'在另一种实施方式中，所述造血细胞是⑶45+。在另一种具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+⑶45+。在另一种实施方式中，所述造血细胞是Thy-Γ。在具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+Thy-l+。在另一种实施方式中，所述造血细胞是⑶113+。在具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+D133+或者⑶133+Thy-l+。在另一种具体的实施方式中，所述⑶34+造血细胞是CXCR4+。在另一种具体的实施方式中，所述⑶34+造血细胞是CXCR4_。在另一种实施方式中，所述造血细胞对于KDR(血管生长因子受体2)是阳性的。在具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+KDR+、⑶133+KDR+或Thy-1+KDR+。在某些其他实施方式中，所述造血细胞对于醛脱氢酶(ALDH+)是阳性的，例如，所述细胞是⑶34+ALDH+。在某些其他实施方式中，所述CD34+细胞是CD45_。在具体的实施方式中，所述 CD34.细胞(例如，CD34+、CD45-细胞)表达微小 RNA hsa-miR-380、hsa-miR-512、hsa-miR-517、hsa-miR-518c、hsa_miR-519b 和 / 或 hsa_miR-520a 中的一种或多种或全部。在某些实施方式中，所述造血细胞是⑶34' 所述造血细胞还可以缺少指示谱系提交的某些标志物或缺少发育纯真性(developmental naivete)。例如，在另一种实施方式中，所述造血细胞是HLA_DR_。在具体的实施方式中，所述造血细胞是CD34+HLA-DR-、CD133+HLA-DIT、Thy-1+HLA-DIT或ALDH+HLA-DR_。在另一种实施方式中，所述造血细胞对于谱系标志物⑶2、⑶3、⑶lib、⑶11c、⑶14、⑶16、⑶19、⑶24、⑶56、⑶66b和血型糖蛋白A中的一种或多种，优选地全部是阴性的。因此，根据表明未分化状态的标志物的存在性或者根据表明至少一些谱系分化发生的谱系标志物的缺少，可以选择造血细胞用于在本文所公开的方法中使用。在(例如)下文6.1.2节中详细讨论了根据特定标志物的存在或缺失的分离细胞(包括造血细胞)的方法。在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以是基本上均质的种群，例如，包含至少约95%、至少约98%或至少约99%的来源于单一组织来源的造血细胞的群体，或包含表现出相同造血细胞相关细胞标志物的造血细胞的群体。例如，在多种实施方式中，所述造血细胞可以包含至少约95%、98%或99%的来源于骨髓、脐带血、胎盘血、外周血或胎盘(例如，胎盘灌洗液)的造血细胞。在本文所提供的方法中使用的造血细胞可以得自单一个体，例如得自单一胎盘；或得自多个个体，例如，可以是混合的。当所述造血细胞得自多个个体并且是混合的时，所述造血细胞可以得自相同组织来源。因此，在多种实施方式中，所述混合的造血细胞全部来自胎盘，例如，胎盘灌洗液；全部来自胎盘血；全部来自脐带血；全部来自外周血等。在某些实施方式中，在本文所公开的方法中使用的造血细胞包含来自两种或更多种组织来源的造血细胞。例如，在某些实施方式中，当将来自两种或更多种来源的造血细胞混合以用于在本文所述方法中使用时，用于产生TSNK细胞的多种造血细胞包含来自胎盘(例如，胎盘灌洗液)的造血细胞。在多种实施方式中，用于产生TSNK细胞的造血细胞包括来自胎盘和来自脐带血的造血细胞；来自胎盘和外周血的造血细胞；来自胎盘和胎盘血的造血细胞，或来自胎盘和骨髓的造血细胞。在优选的实施方式中，所述造血细胞包含来自胎盘灌洗液的造血细胞结合来自脐带血的造血细胞，其中所述脐带血和胎盘来自于相同个体，即，其中所述灌洗液和脐带血是相配的。在其中所述造血细胞包含来自两种组织来源的造血细胞的实施方式中，可以将来自所述来源的造血细胞以下列比值混合物，例如，1:10、2:9、3:8、4:7:、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1。6.1.1.胎盘造血干细胞在某些实施方式中，在本文所提供的方法中使用的造血细胞是胎盘造血细胞。如本文所使用的，“胎盘造血细胞”表示得自胎盘本身的造血细胞，而不是得自胎盘血或脐带血的造血细胞。在一种实施方式中，胎盘造血细胞是⑶34+。在具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞主要是(例如，至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或98%)⑶34+CD3K细胞。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞主要是(例如，至少约50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95% 或 98%)CD34+CD38+ 细胞。胎盘造血细胞可以通过本领域技术人员所知的任何方式(例如，通过灌洗)得自分娩后的哺乳动物(例如，人)胎盘。在另一种实施方式中，所述胎盘造血细胞是⑶45_。在具体的实施方式中，所述造血细胞是⑶34+⑶45—。在另一种具体的实施方式中，所述胎盘造血细胞是⑶34+⑶45+。6.2.自然杀伤细胞的产生通过本发明所述方法的NK细胞的产生包括扩增造血细胞群体。在细胞扩增期间，造血细胞群体内的多个造血细胞分化为NK细胞。在一种实施方式中，本文提`供了产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的方法，包括:(a)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和6)将来自步骤(a)的细胞在包含白细胞介素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。在另一种实施方式中，通过NK细胞的扩增/分化和成熟的两步方法产生了本文提供的NK细胞。所述第一和第二步骤包括在具有细胞因子独特组合的培养基中培养细胞。在某些实施方式中，该方法包括(a)在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体，其中所述造血细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞分化为NK细胞；和(b)在第二培养基中扩增得自步骤(a)的NK细胞，其中所述NK细胞进一步扩增和分化，并且其中所述NK细胞成熟(例如，激活或否则具有细胞毒素活性)。在某些实施方式中，所述方法在步骤(a)和(b)之间不包含中间步骤，在步骤(a)之前不包含其他培养步骤，和/或在步骤(b)之后不包含其他步骤(例如，成熟步骤)。6.2.1.第一培养步骤在某些实施方式中，本文所提供的方法包括在第一培养基中培养和扩增造血细胞群体的第一步骤，其中造血细胞种群内的多个造血干细胞或祖细胞分化为NK细胞。不希望受任何参数、机制或理论的束缚，如本文所提供的造血细胞的培养导致所述造血细胞的连续扩增和从所述细胞向NK细胞的分化。在某些实施方式中，使用饲养层将在本文所提供的方法中使用的造血细胞(例如，干细胞或祖细胞)在第一步骤中扩增和分化。在其他实施方式中，不使用饲养层将造血细胞(例如，干细胞或祖细胞)在第一步骤中扩增和分化。造血细胞不依赖于饲养细胞的扩增和分化可以在与细胞培养和扩增相容的任何容器中发生，例如，三角瓶、管、烧杯、培养皿、多孔板、袋等。在具体的实施方式中，造血细胞不依赖于饲养细胞的扩增在袋中进行，例如，柔韧的透气性碳氟化合物培养袋(例如，获自American Fluoroseal)。在具体的实施方式中，在其中扩增所述造血细胞的容器适合于运输(例如)至其中将所述扩增的NK细胞进一步扩增并分化的地点，如医院或部队区。在某些实施方式中，在第一培养基中以(例如)连续方式扩增和分化造血细胞。在一种实施方式中，所述第一培养基是不含动物成分的培养基。在本文所提供的方法中有用的示例性不含动物成分的培养基包括(但不限于)伊格尔基础培养基(BME)、达尔伯克改良的伊格尔培养基(DMEM)、格拉斯哥极限必须 培养基(GMEM)、达尔伯克改良的伊格尔培养基/营养混合物F-12Ham (DMEM/F-12)、极限必须培养基(MEM)、伊思考夫改良达尔伯克培养基(HffiM)、汉姆氏营养混合物F-1O (汉姆氏F-10)、汉姆氏营养混合物F-12 (汉姆氏F-12)、RPM1-1640培养基、威廉姆斯培养基E、STEMSPAN (产品目录号N0.Stem CellTechnologies, Vancouver, Canada)、Glycostem 基础生长培养基(GBGM(丨 ))、AIM-V 培养基(Invitrogen)、X-VIVOtmIO (Lonza), X-VIVOtmI5 (Lonza)、OPTMIZER (Invitrogen)、STEMSPAN H3000 (STEMCELL Technologies)、CELLGRO COMPLETE (Mediatech)或它们的任何改良变化形式或组合。在优选实施方式中，所述第一培养基包含一种或多种培养基补充剂(例如，营养物、细胞因子和/或因子)。适合于在本文所提供的方法中使用的培养基补充剂(例如)无限制地包括血清(如人血清AB、胎牛血清(FBS)或者胎牛血清(FCS))、维生素、牛血清白蛋白(BSA)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和人转铁蛋白)、β -巯基乙醇、干细胞因子(SCF)、Fms样酪氨酸激酶3配体(FK3-L)、细胞因子(如白细胞介素-2 (IL-2)、白细胞介素-7 (IL-7)、白细胞介素-15 (IL-15)、促血小板生成素(Τρο)、肝素或O-乙酰-卡尼汀(也称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或者0AC)。在具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含人血清ΑΒ。在另一种具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含FBS。在另一种具体的实施方式中，本文所使用的培养基包含0AC。在某些实施方式中，所述第一培养基不包含粒性白细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒性白细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、白细胞介素-6(IL-6)、巨噬细胞炎性蛋白Ia(MIPla )或白血病抑制因子(LIF)中的一种或多种。因此，在一个方面，本文提供了产生NK细胞的两步法，其中所述第一步包括在不存在饲养细胞的情况下在第一培养基中扩增和分化造血细胞群体，其中所述造血细胞群体内的多个造血细胞在所述扩增期间分化为NK细胞，并且其中所述培养基包含浓度为约I至约150ng/mL的SCF、浓度为约50至约1500IU/mL的IL-2、浓度为约I至约150ng/mL的IL-7、浓度为I至约150ng/mL的IL-15和浓度为约0.1至约30IU/mL的肝素，并且其中所述SCF、IL-2、IL-7、IL-15和肝素不包含在所述培养基的不明确的组分内(例如，血清)。在某些实施方式中，所述培养基包含O-乙酰-卡尼汀(还称为乙酰肉毒碱、O-乙酰-L-卡尼汀或OAC)或影响线粒体中乙酰辅酶A循环的化合物、N-苄基-2-(嘧啶-4-基氨基)噻唑-4-甲酰胺(thiazovivin)、Y_27632、pyintegrin、P激酶(ROCK)抑制剂、半胱天冬氨酸酶抑制剂或其他抗凋亡化合物/肽、NOVA-RS (Sheffield Bio-Science)或其他小分子生长增强因子中的一种或多种。在某些实施方式中，所述培养基包含烟酰胺。在某些实施方式中，所述培养基包含约0.5mM-10mM OAC0在一种实施方式中，所述培养基包括Stemspan' H3000和/或DMEM:F12和约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9或IOmM的0AC。在所述方法的具体实施方式
中，所述培养基是GBGM 。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含Stemspan H3000和约5mM的0AC。在另一种具体的实施方式中，所述培养基包含DMEM:F12和约5mM的0AC。可以在本文所提供的培养法期间的任何时候加入0AC。在某些实施方式中，将所述OAC加入到第一培养基中和/或在第一培养步骤期间加入。在一些实施方式中，在培养的第0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21 天将所述 OAC 加入到第一培养基中。在具体的实施方式中，在第一培养步骤的第7天将所述OAC加入到第一培养基中。在更具体的实施方式中，在培养的第7天将所述OAC加入到第一培养基中并且在整个第一和第二培养步骤期间存在。在某些实施方式中，将所述OAC加入到第二培养基中和/或在第二培养步骤期间加入。在一些实施方式中，在培养的第22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35天将所述OAC加入到第二培养基中。在另一种具体的实施方式中，所述培养基是添加了约5_20%BSA、约1_10 μ g/mL重组人胰岛素、约10-50 μ g/mL铁饱和人转铁蛋白和约10-50 μ M β -巯基乙醇的頂DM。在另一种具体的实施方式中，所述培养基不包含IL-11、IL-3、同源框-B4 (HoxB4)和/或甲基纤维素中的一种或多种或任一种。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL ;约5至约100ng/mL ;或者约20ng/mL的SCF。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约10至约2000IU/mL ;或者约100至约500IU/mL ;或者约200IU/mL的IL-2。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL ;约5至约100ng/mL ;或者约20ng/mL的IL-7。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL ;约5至约lOOng/mL ;或者约10ng/mL的IL-15。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.05至约100U/mL ;或者约0.5至约20U/ml ;或者约1.5U/mL的肝素。
在所述方法的其他具体实施方式
中，所述培养基还包含浓度约I至约150ng/mL的Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt-3L)、浓度约I至约150ng/mL的促血小板生成素(Tpo)或两者的组合。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约0.1至约500ng/mL ;约5至约100ng/mL ;或者约20ng/mL的Flt_3L。在其他具体的实施方式中，所述培养基包含浓度约 0.1 至约 500ng/mL ;约 5 至约 100ng/mL ;或者约 20ng/mL 的 Τρο。在所述方法的更具体的实施方式中，所述第一培养基是GBGM ,其包含约20ng/mL的SCFjy^ 20ng/mL的IL-7、约10ng/mL的IL-15。在所述方法的另一种更具体的实施方式中，所述第一培养基是GBGM ，其包含约20ng/mL的SCFj^ 20ng/mL的Flt3_L、约 200IU/mL 的 IL-2、约 20ng/mL 的 IL-7、约 10ng/mL 的 IL-15、约 20ng/mL 的 Tpo 和约 1.5U/mL的肝素。在另一种具体的实施方式中，所述第一培养基还包含10%的人血清(例如，人血清AB)或胎儿血清(例如，FBS)。在另一种实施方式中，通过将造血细胞在(例如)所述第一培养基中以与未接触所述免疫调节化合物的相等个数的造血细胞相比在给定时间内足以导致所述造血细胞增殖的可检测增加的时间和量与免疫调节化合物(例如，TNF-α抑制化合物)接触来扩增所述细胞。参见(例如)美国专利申请公开N0.2003/0235909，该专利的公开内容以其全部内容作为参考并入本文。在某些实施方式中，所述免疫调节化合物是氨基取代的异吲哚啉。在优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是3-(4-氨基-1-氧代-1，3- 二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮；3-(4’氨基异吲哚啉-1’-酮)-1_哌啶-2，6-二酮；4_(氨基)-2- (2，6- 二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1，3- 二酮或4-氨基-2- (2，6- 二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1，3-二酮。在另一种优选的实施方式中，所述免疫调节化合物是玻马利度胺(pomalidomide)或来那度胺。在另一种实施方式中,所述免疫调节化合物是具有以下结构的化合物
权利要求
1.种产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的方法，包括: Ca)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和 (b )将来自步骤(a)的所述细胞在包含干扰白细胞素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
2.种产生激活的自然杀伤(NK)细胞群体的两步法，其中，所述方法的第一步包括在包含干细胞因子(SCF)、白细胞介素-7 (IL-7)和白细胞介素-15 (IL-15)中的一种或多种的第一培养基中扩增造血干细胞或祖细胞群体，并且其中所述SCF、IL-7和IL-15不包含在所述培养基的不明确的组分中，并且其中所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和 其中所述方法的第二步包括在包含干扰白细胞素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增来自所述第一步的细胞，以产生激活的NK细胞。
3.据权利要求1所述的方法，其中，所述第一培养基还包含Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、促血小板生成素(Τρο)、白细胞介素-2 (IL-2)或肝素中的一种或多种。
4.据权利要求3所述的方法，其中，所述第一培养基还包含胎牛血清或人血清。
5.据权利要求3所述的方法，其中，所述SCF在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。
6.据权利要求3所述的 方法，其中，所述Flt3-L在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。
7.据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-2在所述第一培养基中以约50至约1500IU/mL的浓度存在。
8.据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-7在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。
9.据权利要求3所述的方法，其中，所述IL-15在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。
10.据权利要求3所述的方法，其中，所述Tpo在所述第一培养基中以约I至约150ng/mL的浓度存在。
11.据权利要求3所述的方法，其中，所述肝素在所述第一培养基中以约0.1至约30U/mL的浓度存在。
12.据权利要求1所述的方法，其中，在所述第二步中所述IL-2在所述第二培养基中以50至约1500IU/mL的浓度存在。
13.据权利要求1所述的方法，其中，所述第二培养基另外包含胎牛血清(FCS)、转铁蛋白、胰岛素、乙醇胺、油酸、亚油酸、棕榈酸、牛血清白蛋白(BSA)和植物凝集素中的一种或多种。
14.据权利要求1所述的方法，其中，所述造血干细胞或祖细胞是CD34+。
15.据权利要求1所述的方法，其中，所述造血干细胞或祖细胞包括来自人胎盘灌洗液的造血干细胞或祖细胞和来自脐带的造血干细胞或祖细胞，其中所述胎盘灌洗液和所述脐带血来自于相同胎盘。
16.据权利要求1所述的方法，其中，步骤(b)中的所述饲养细胞包括丝裂霉素C处理的外周血单核细胞(PBMC)、K562细胞或组织培养贴壁干细胞。
17.据权利要求1所述的方法，其中，所述NK细胞是⑶3TD56+⑶16_。
18.据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD94+CD117+。
19.据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD161—。
20.据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是NKG2D+。
21.据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是NKp46+。
22.据权利要求17所述的方法，其中，所述NK细胞另外是CD226+。
23.过以下方法获得的激活的NK细胞群体，所述方法包括: Ca)将造血干细胞或祖细胞群体接种到包含白细胞介素-15 (IL-15)并可选地包含干细胞因子(SCF)和白细胞介素-7 (IL-7)中的一种或多种的第一培养基中，其中所述IL-15和可选的SCF和IL-7不包含在所述培养基的不明确的组分中，从而所述群体扩增并且所述造血干细胞或祖细胞群体内的多个造血干细胞或祖细胞在所述扩增期间分化为NK细胞；和 (b)将来自步骤(a)的所述细胞在包含干扰白细胞素-2 (IL-2)的第二培养基中扩增，以产生激活的NK细胞群体。
24.种抑制肿瘤细胞增殖的方法，包括将所述肿瘤细胞与多个CD94+CD117+NK细胞接触，其中所述NK细胞已通过根据权利要求1所述的方法产生。
25.据权利要求24所述的方法，其中，所述肿瘤细胞是原发性导管癌细胞、成胶质细胞瘤细胞、白血病细胞、急性T细胞白血病细胞、慢性脊髓淋巴瘤(CML)细胞、急性髓性白血病细胞、慢性粒细胞性白血病(CML)细胞、肺癌细胞、结肠腺癌细胞、组织细胞淋巴瘤细胞、多发性骨髓瘤细胞、结直肠癌细胞、结直肠腺癌细胞、前列腺癌细胞或视网膜母细胞瘤细胞。
全文摘要
本文提供了使用两步扩增和分化方法产生自然杀伤细胞的方法。本文还提供了抑制肿瘤细胞增殖、治疗患有癌或病毒感染的个体的方法，包括将通过所述方法产生的NK细胞施用给患有癌或病毒感染的个体。
文档编号C12N5/0783GK103097520SQ201180043919
公开日2013年5月8日 申请日期2011年7月13日 优先权日2010年7月13日
发明者罗伯特·J·哈黎里, 穆罕默德·A·黑德兰, 斯蒂芬·亚什科, 康琳, 埃里克·劳, 阿贾伊·帕尔, 芭娃妮·斯托特, 瓦内萨·沃斯基纳里安-贝尔斯, 安德鲁·查特林, 张小葵 申请人:人类起源公司