专利名称：一种荧光探针及其合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及化学分析，生物分析，临床医学检测领域，尤其涉及一种荧光 探针及其合成方法和用途。
胰酶是以胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶为主组成的多种酶的混合物，可 以促进蛋白质、淀粉及脂肪的消化。胰蛋白酶是一种胰腺分泌的丝氨酸蛋白酶 类，对带正电荷的赖氨酸、精氨酸残基的肽键具有选择性。胰蛋白酶还具有酯 酶和酰胺酶的活性，能够水解酯键和酰胺键。脂肪酶可以水解甘油三酯的酯键。 胰酶的活性能够被有机磷化合物、苯甲基璜酰氟以及来源于胰脏、大豆、利马 豆、蛋清的天然胰酶抑制剂等抑制。胰酶活性的异常与很多胰腺疾病有关，所 以胰酶抑制剂具有重要的基础和临床价值，开发胰酶抑制剂筛选的方法也具有 重要意义。
目前常用苯甲酰-L-精氨酸-对硝基苯胺和苯甲酰-L-精氨酸-P-萘酰胺测定酰 胺酶活力；用苯甲酰-L-精氨酸乙酯和对甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯测定酯酶活力。 与上述这些基于紫外吸收的测定方法相比，荧光检测方法具有更高的灵敏度。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种荧光探针及其合成方法和 用途。
荧光探针具有如下结构式
荧光探针的合成方法包括如下步骤
l)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为l: 2 10: l的丁二 酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚，反应12 24h;在5 10。C下依次滴加三乙胺、三 氟化硼乙醚，摩尔比为5: 6 8，氮气保护下继续反应24 36h;用饱和食盐水 洗2 3次，有机相用无水Na2S04干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得
背景技术：
3到中间产物；
2)以二氯甲垸为溶剂，加入摩尔比为1:1 2:1 2:0.1 0.2的上述中间产物、 3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应l 2h;过滤， 减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
荧光探针用于化学体系、生物体系中的胰酶和脂肪酶活性检测分析，用于 胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂的筛选。
本发明的优点是l)荧光探针的合成仅需两步反应，，且后处理简单；2)原 料易得，成本低廉；3)该荧光探针具有非常高的检测灵敏度，适合微量检测，有 良好的应用前景。
图1在37"C下，10 探针在磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)溶液中，与0-0.02% 胰酶反应30 min后的荧光发射光谱；
图2在37'C下，10 探针在磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)溶液中，与0-0.02% 脂肪酶反应30 min后的荧光发射光谱；
图3在37。C下，lOjiiM探针的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)溶液中，分别加 入终浓度0-80 (iM的苯甲基璜酰氟，再加入0.02%的胰酶，反应30 min后的荧 光发射光谱；
图4在37。C下，10 探针的磷酸盐缓冲溶液(pH7.4)溶液中，分别加 入终浓度0-80 ^M的苯甲基璜酰氟，再加入0.02%的脂肪酶，反应30min后的 荧光发射光谱。
具体实施方式
本发明的合成方程式
COOH
H
1) Et20-BF3 一
2) TEA, Et20-BF3
DCC, DMAP
实施例1
1)在氮气保护下，以二氯甲垸为溶剂，加入摩尔比为1: 10: 1的丁二f 酐(lOmmol)、吡咯(lOOmmol)、三氟化硼乙醚(lOmmol)，反应24h;在5'
4l(TC下依次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(80 mmol)，氮气保护下继 续反应36h;用饱和食盐水洗3次，有机相用无水Na2S04干燥，减压蒸馏除去 溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物0.25g，产率9.4%;
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1:2:2:0.2的上述中间产物(0.2 mmol)、 3-(二乙氨基)-苯酚(0.4mmo1)、 二环己基碳二亚胺(0.4 mmol)、 4-二甲氨基吡 啶(0.04 mmol)，反应2h;过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光 探针0.020g，产率24%。 实施例2
1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1: 2: 1的丁二酸 酐(lOmmol)、吡咯(20mmo1)、三氟化硼乙醚(lOmmol)，反应12h;在5 l(TC下依次滴加三乙胺(50 mmol)、三氟化硼乙醚(60 mmol)，氮气保护下继 续反应24h;用饱和食盐水洗2次，有机相用无水Na2S04干燥，减压蒸馏除去 溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物0.22g，产率8.3%;
2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为l丄l:O.l的上述中间产物(0.2mmo1)、 3-(二乙氨基)-苯酚(0.2mmo1)、 二环己基碳二亚胺(0.2 mmol)、 4-二甲氨基吡 啶(0.02 mmol)，反应lh;过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光 探针。最终得到中间产物0.019 g，产率23%。 实施例3
1) 在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为l: 2: l的丁二酸酐、 吡咯、三氟化硼乙醚，反应12h;在5 1(TC下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚， 摩尔比为5: 6，氮气保护下继续反应24h;用饱和食盐水洗2次，有机相用无 水Na2S04干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2) 以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1:1:1:0.1的上述中间产物、3-(二乙氨 基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应lh;过滤，减压蒸馏除去 溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
实施例4
1) 在氮气保护下，以二氯甲垸为溶剂，加入摩尔比为1: 10: 1的丁二酸 酐、吡咯、三氟化硼乙醚，反应24h;在5 10'C下依次滴加三乙胺、三氟化硼 乙醚，摩尔比为5: 8，氮气保护下继续反应36h;用饱和食盐水洗3次，有机 相用无水Na2S04干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；
2) 以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1:2:2:0.2的上述中间产物、3-(二乙氨 基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应2h;过滤，减压蒸馏除去
5溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。 实施例5
1) 将丁二酸酐(10mmo1)、吡咯(20rnrno1)、 BF3'OEt2(10 mmol)加入到三颈 烧瓶中，氮气保护下注入100ml二氯甲烷；搅拌反应12小时后，在5 1(TC下 依次小心滴加三乙胺(50mmo1)、三氟化硼乙醚(60 mmol)，氮气保护下继续反应 36h;反应结束后，反应溶液用饱和食盐水洗两次(2 x 20 mL)，有机相用无水硫 酸钠干燥，之后真空旋干有机溶剂。得到的黑色油状物用硅胶柱层析分离(洗 脱剂选用石油醚乙酸乙酯=1: 1)。最终得到中间产物0.22 g，产率8.3%。熔 点160画162。C; 丽R (400 MHz, CDC13) 5 7.88 (s， 2H), 7.32 (d， 2H， J=4 Hz)， 6.56 (d, 2H, /=3.2 Hz), 3.28 (t， 2H, J=8 Hz), 2.84 (t, 2H, 7=8 Hz); 13C NMR (100MHz, CDC13) S 180.0, 147.2， 144.3， 134.8, 128.0， 118.5, 36.3, 25.5; IR (film) Wcm.1: 2913, 1708, 1633, 1567, 1414, 1392, 1260， 1110， 1080, 1041, 956; ESI Mass: m/z=286.9 (M+Na+). HRMS (ESI): m/z calcd for (C12HuBF2N202-H)—: 263.0803, found 263.0807。
2) 将上述中间产物(0.2mmol)、 二环己基碳二亚胺(0.2 mmol)、 4-二甲氨基 吡啶(0.02mmol)、3-(二乙氨基)-苯酚(0.2 mmol)溶解在干燥的二氯甲烷中(10 ml), 室温下搅拌反应l小时。旋转蒸干溶剂，硅胶柱层析分离，得最终产物20mg， 产率24%。 & NMR (400 MHz, CDC13) 5 7.89 (s, 2H), 7.39 (d, 2H, J=4 Hz), 7.17 (t, 1H， J=8 Hz)， 6.57 (d, 2H, J=3.2 Hz), 6.53 (dd, 1H, J=8.4 Hz, J=2.4 Hz), 6.29 (d， 1H， J=8 Hz), 6.24-6.27 (m, 1H), 3.38 (t, 2H, J=8 Hz)， 3.32 (q, 4H, J=5.2 Hz), 3,02 (t， 2H， J=8 Hz), 1.51 (t, 6H, J=7.2 Hz); 13C NMR (100MHz, CDC13) 5 170.2, 151.7， 149.0， 147.6， 144.2， 134.9， 129.8, 128.2, 118.4, 109.4， 107.6, 104.2, 44.3, 37.0， 25.8， 12.5; IR (film) v/cm-1:2928, 1751, 1570, 1414, 1395, 1262, 1194， 1113, 1083, 1045; MS (ESI): m/z= (M+H)+ :412.1; HRMS (ESI): m/z calcd for (C22H24BF2N302+H)+: 412.2002， found 412.1999; calcd for (C22H24BF2N302+Na)+: 434.1822, found 434.1815。
实施例6
使用探针检测检测胰酶及脂肪酶的活性。胰酶和脂肪酶溶液用PBS(pH 7.4) 配帝U，终浓度分别为O， 0.005， 0.010， 0.015， 0.020%。加入探针，使其终浓度 为10pM。 37"C下下反应30分钟后，采用荧光光谱仪检测荧光发射光谱，激发 波长488nm，狭缝宽度1.5nm。 实施例7以苯甲基璜酰氟为例，使用探针检测胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂对酶活性
的抑制作用。苯甲基璜酰氟用DMSO配制成10mM储备液小心存放，用前使用 PBS (pH 7.4)稀释，终浓度分别为0， 20， 40， 60， 80 )liM。加入探针，使其 终浓度为10pM。最后加入0.020%的胰酶或0.01%的脂肪酶，37。C下反应30分 钟后，采用荧光光谱仪检测荧光发射光谱，激发波长488nm，狭缝宽度1.5nm。
权利要求
1、一种荧光探针，其特征在于该荧光探针具有如下结构式
2、 一种如权利要求1所述荧光探针的合成方法，其特征在于包括如下步骤:1) 在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为l: 2 10: l的丁二 酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚，反应12 24h;在5 1(TC下依次滴加三乙胺、三 氟化硼乙醚，摩尔比为5: 6 8，氮气保护下继续反应24 36h;用饱和食盐水 洗2 3次，有机相用无水Na2S04干燥，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得 到中间产物；2) 以二氯甲垸为溶剂，加入摩尔比为1:1 2:1 2:0.1 0.2的上述中间产物、 3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应l 2h;过滤， 减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。
3、 一种如权利要求1所述荧光探针的用途，其特征在于用于化学体系、生 物体系中的胰酶和脂肪酶活性检测分析，用于胰酶抑制剂和脂肪酶抑制剂的筛 选。
全文摘要
本发明公开了一种荧光探针及其合成方法和用途。合成方法包括如下步骤1)在氮气保护下，以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶2～10∶1的丁二酸酐、吡咯、三氟化硼乙醚，反应；依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩尔比为5∶6～8，反应；用饱和食盐水洗，干燥，减压蒸除溶剂，用硅胶柱层析得到中间产物；2)以二氯甲烷为溶剂，加入摩尔比为1∶1～2∶1～2∶0.1～0.2的上述中间产物、3-(二乙氨基)-苯酚、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶，反应；过滤，减压蒸馏除去溶剂，用硅胶柱层析得到荧光探针。本发明的荧光探针的合成仅需两步反应，且后处理简单；原料易得，成本低廉；具有非常高的检测灵敏度，适合微量检测，有良好的应用前景。
文档编号G01N21/64GK101550156SQ20091009853
公开日2009年10月7日 申请日期2009年5月14日 优先权日2009年5月14日
发明者洋 刘, 王彦广, 啸 董 申请人:浙江大学