专利名称：检测细胞羟基自由基的荧光探针及合成方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物检测技术及临床医学检测领域，涉及检测细胞羟基自由基的荧光探针；同时涉及该荧光探针的合成方法；另外，还涉及该荧光探针的用途。
背景技术：
生命活动的代谢过程中产生各种自由基，生物体的衰老及许多疾病的发生与自由基都有重要关系。自由基能够介导生命活动的许多重要反应过程，参与细胞免疫功能，对组织细胞的化学结构发生破坏性修饰，损伤正常组织细胞的形态和膜功能(Witz G.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1991，198675；Feig D.I.，Reid T.M.，Leob L.A.，Cancer Res.1994，541890s；Finkl T.，Hol brook N.J.，Nature 2000，408239)。羟自由基是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞噬有关(de Lara C.M.，JennerT.J.，Townsend K.M.S.，Marsden S.J.，O’Neill P.，Radiat.Res.1995，14443；StadtmanE.R.，Annu.Rev.Biochem.1993，62797；Tien M.，Svingen B.A.，Arch.Biochem.Biophys.1982，216142)。
自由基寿命短、含量低、种类多，对其检测是生命科学与化学分析领域最困难的问题之一。羟基自由基作为一种生命活动过程中产生的目前己知氧化性最强的自由基，其检测尤为重要。国内外文献报道的检测羟自由基的主要方法有电子自旋共振法(Huycke M.M.，Moore D.R.，Free Rad.Bio.Med.2002，33818)，高效液相色谱法(Kaur H.，Hsllinell B.，Anal.Biochem.1994，22011)，荧光法(Ou B.，Hampsch-Woodill，M.，Flanagan J.，Deemer E.K.，Prior R.L.，Huang D.，J.Agric.Food Chem.2002，502772；Shinichiro T.，Hideaki I.，Shota T.，TatsuyaS.，Fumiaki H.，Mitsunobu N.，Tetsuo N.，Neurosci Res.2005，53304)。荧光检测法灵敏度高、选择性好、响应速度快，较其它方法显示出较强的优越性，结合共聚焦显微成像技术，能够实现活体细胞和组织内的活性氧“实时、可见、定量”的检测。目前已报道用于细胞内一氧化氮和过氧化氢检测成像的荧光探针(Sasaki E.，Kojima H.，Nishimatsu H.，Urano Y.，Kikuchi K.，Hirata Y.，Nagano T.，J.Am.Chem.Soc.2005，127，3684；Xu K H.，Tang B.，Huang H.，Yang G.W.，Chen Z.Z.，Li P.，An L.G.，Chem.Commun.2005，48，5974)，而基于荧光共振能量转移原理用于细胞内羟基自由基检测成像的荧光探针尚未见报道。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种响应时间短，测定灵敏度高，对细胞的渗透性好，毒副作用小，适用于生物体内羟基自由基检测的基于荧光共振能量转移原理的金猝灭的荧光寡核苷酸探针，为生物样品中低含量的羟基自由基检测，探讨人类疾病及老化的机制以及某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段；目的之二是提供一种工艺简单的该荧光探针的合成方法；目的之三是提供该荧光探针的用途。
本发明的目的之一可通过如下技术措施来实现本发明的荧光探针选择DNA寡核苷酸链单链作为荧光共振能量转移发生的载体，5’端修饰荧光素(激发波长490nm，发射波长520nm)作为能量供体，3’端修饰巯基键合金纳米粒子作为能量受体，该探针具有如下结构式 式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸链单链，任意碱基序列，碱基个数为2-30个；荧光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；金纳米粒子直径为3-32nm。
本发明的目的之二可通过如下技术措施来实现该合成方法按如下步骤进行a.取重量浓度为0.01-0.02％的氯金酸溶液150.0体积份加热回流，搅拌下加入重量浓度为1.0-2.0％的柠檬酸三钠溶液5.0-7.0体积份，继续回流10-20分钟，室温下放置冷却，得金纳米粒子溶液；b.将金纳米粒子溶液与5’端修饰荧光素3’端修饰巯基的DNA单链按照1∶200-500物质的量配比混匀，室温下放置12-24小时，再用磷酸缓冲液调pH＝7.0-7.8；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为0.5-5mol/L的氯化钠溶液按1∶0.1-0.3体积份配比混匀，室温下放置35-45小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.1-0.3mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
本发明的目的之三可通过如下技术措施来实现将所述的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的荧光成像的检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。为探讨人类疾病及老化的机制以及某些重大疾病的早期诊断与预防，提供良好的辅助手段。
本发明的金猝灭的荧光寡核苷酸探针在水相中合成，通常加入含有细胞及组织的适当缓冲液中进行测试。
本发明基于荧光共振能量转移原理，利用金猝灭的荧光寡核苷酸探针专一性识别活细胞内羟自由基。探针选择DNA寡核苷酸单链作为发生荧光共振能量转移的载体，5’端修饰荧光素作为能量供体，3’端修饰巯基键合金纳米粒子作为能量受体。金纳米粒子具有高消光系数使荧光探针具有低的空白荧光信号；羟基自由基引起DNA链断裂导致荧光共振能量转移现象消失，金纳米粒子猝灭荧光素的荧光随之得到恢复，据此实现纳摩尔级浓度的细胞羟基自由基的检测。
细胞内羟基自由基检测的一般方法是将培养好的细胞分成两部分，一部分用刺激剂佛波脂刺激，使细胞内产生大量的超氧阴离子自由基，之后的自由基链式反应能够生成羟基自由基，用培养液冲洗后，进行激光共聚焦显微成像。未刺激的细胞用激光共聚焦显微镜成像得到空白对比图像。
本发明的荧光探针具有重要的应用价值，该探针响应时间短，测定灵敏度高，对细胞的渗透性好，毒副作用小，使得这类探针作为测定生物体内羟基自由基的试剂有很好的实际利用价值。
本发明的荧光探针的具体特征如下1、本发明荧光探针的设计基于荧光共振能量转移原理，金纳米粒子具有高消光系数，在荧光素-金纳米粒子组成的荧光共振能量转移供受体对中发挥突出的荧光猝灭作用。羟自由基对脱氧核糖部分的氧化侵蚀会使DNA寡核苷酸单链释放出自由碱基，引起DNA链断裂和脱碱基位点，羟自由基引起DNA链断裂导致荧光共振能量转移现象消失，金纳米粒子猝灭荧光素的荧光随之得到恢复，实现羟基自由基的测定。荧光探针表现出良好的选择性，体内存在的其它种类的活性氧及体内存在的谷胱甘肽不对检测造成干扰。
2、本发明荧光探针对羟基自由基的检测范围为8.0×10-9-1.0×10-6mol/L，可以检测纳摩尔浓度的细胞内羟基自由基。激光共聚焦显微镜成像实验证明探针分子能够穿透细胞膜进入细胞内部捕获羟基自由基，对细胞本身没有毒副作用，并且能够对细胞内纳摩尔级的羟基自由基含量变化进行检测。
3、本发明荧光探针选择金纳米粒子作为荧光共振能量转移的受体，在紫外光区及可见光区具有宽谱吸收，可以有效避免细胞自发荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体的损伤，有利于活体检测。
图1是本发明的荧光探针与不同浓度的羟基自由基作用后体系的发射谱图，谱图中包含羟基自由基的清除剂二甲基亚砜用来进一步证实探针的实用性，横坐标为波长(Wavelength/nm)，纵坐标为荧光强度(Counts)；图2是本发明的荧光探针与羟基自由基作用后体系的荧光强度与反应时间的关系，横坐标为时间(Time)，纵坐标为相对荧光强度(Counts)；
图3是本发明的荧光探针对比羟基自由基(·OH)与过氧化氢(H2O2)，过氧亚硝基阴离子(ONOO)，超氧阴离子自由基(O2-.)，单线态氧(1O2)，谷胱甘肽(GSH)，次氯酸钠(NaClO)，一氧化氮自由基(NO·)，脂过氧自由基(ROO·)的荧光响应，横坐标为各种自由基及生物化合物，纵坐标为对应的荧光强度(Counts)；图4是本发明的荧光探针研究小鼠巨噬细胞(RAW 264.7)的激光共聚焦显微成像；图5是荧光探针工作原理图。
探针对羟基自由基的选择性对比了探针对羟基自由基及其它自由基和生物化合物的荧光响应。终浓度1umol/L的过氧化氢，过氧亚硝基阴离子，超氧阴离子自由基，单线态氧，谷胱甘肽，次氯酸钠，一氧化氮自由基，脂过氧自由基加到含有探针pH＝7.4的磷酸缓冲溶液中，探针激发波长为490nm，发射波长为520nm，测试结果显示于图3中。从图中可以看到，化合物对羟基自由基具有很高的灵敏度，羟基自由基的加入产生相对强的荧光信号，而其它种类的活性氧荧光背景干扰极低，显示了探针对于羟基自由基的良好选择性。
细胞培养RAW 264.7细胞由高糖DMEM培养液培养，成像前，细胞贴壁于盖波片上，一部分细胞用刺激剂佛波脂(2ng/ml)刺激30分钟或1小时，未刺激的细胞作为空白，然后加入探针缓冲液，37℃中孵育30分钟，进行激光共聚焦显微成像。
激光共聚焦成像从图3可以看出，未经刺激剂佛波脂刺激的巨噬细胞内部含有的的量微乎其微，难以进行荧光显像(图4a)，经过探针孵育的巨噬细胞经过佛波脂分别刺激30分钟和1小时后发出强烈的荧光(图4b和图4c)，表明细胞内刺激生成的羟基自由基切断DNA单链导致荧光共振能量转移现象消失，荧光素荧光信号恢复。图4d为亮场下的细胞图像。
具体实施例方式
实施例1探针的合成
式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸链单链，任意碱基序列，碱基个数为2-30个；荧光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；SH巯基金纳米粒子直径为3-32nm。
a.取重量浓度为0.01％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的锥形瓶中，加热回流，搅拌下加入重量浓度为2.0％的柠檬酸三钠溶液5.0mL，继续回流20分钟，在室温下放置冷却，得到深红色金纳米粒子溶液；透射电子显微镜结果显示，粒子的平均粒径为15.5nm，按完全反应估算，粒子浓度为1.2×1015/L。
b.将金纳米粒子溶液与5’端修饰荧光素3’端修饰巯基的DNA单链按照1∶200物质的量配比混匀，室温下放置24小时，再用磷酸缓冲液调pH＝7.0；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为5mol/L的氯化钠溶液按1∶0.1体积份配比混匀，室温下放置45小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.1mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
实施例2a.取重量浓度为0.02％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的锥形瓶中，加热回流，搅拌下加入重量浓度为1.0％的柠檬酸三钠溶液7.0mL，继续回流10分钟，在室温下放置冷却，得到深红色金纳米粒子溶液；透射电子显微镜结果显示，粒子的平均粒径为15.9nm，按完全反应估算，粒子浓度为1.2×1015/L。
b.将金纳米粒子溶液与5’端修饰荧光素3’端修饰巯基的DNA单链按照1∶500物质的量配比混匀，室温下放置12小时，再用磷酸缓冲液调pH＝7.8；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为0.5mol/L的氯化钠溶液按1∶0.3体积份配比混匀，室温下放置35小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.3mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
实施例3a.取重量浓度为0.015％的氯金酸溶液150.0mL于250mL的锥形瓶中，加热回流，搅拌下加入重量浓度为1.5％的柠檬酸三钠溶液6.0mL，继续回流15分钟，在室温下放置冷却，得到深红色金纳米粒子溶液；透射电子显微镜结果显示，粒子的平均粒径为15.7nm，按完全反应估算，粒子浓度为1.2×1015/L。
b.将金纳米粒子溶液与5’端修饰荧光素3’端修饰巯基的DNA单链按照1∶350物质的量配比混匀，室温下放置18小时，再用磷酸缓冲液调pH＝7.5；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为3mol/L的氯化钠溶液按1∶0.2体积份配比混匀，室温下放置40小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.2mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
权利要求
1.检测细胞羟基自由基的荧光探针，其特征在于该荧光探针具有如下结构式 式中AGGGTTAGGGDNA寡核苷酸链单链，任意碱基序列，碱基个数为2-30个；荧光素X1，X2＝F，Cl，CH3，OCH3；金纳米粒子直径为3-32nm。
2.检测细胞羟基自由基的荧光探针的合成方法，其特征在于该方法按如下步骤进行a.取重量浓度为0.01-0.02％的氯金酸溶液150.0体积份加热回流，搅拌下加入重量浓度为1.0-2.0％的柠檬酸三钠溶液5.0-7.0体积份，继续回流10-20分钟，室温下放置冷却，得金纳米粒子溶液；b.将金纳米粒子溶液与5’端修饰荧光素3’端修饰巯基的DNA单链按照1∶200-500物质的量配比混匀，室温下放置12-24小时，再用磷酸缓冲液调pH＝7.0-7.8；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为0.5-5mol/L的氯化钠溶液按1∶0.1-0.3体积份配比混匀，室温下放置35-45小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.1-0.3mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
3.权利要求1的检测细胞羟基自由基的荧光探针的用途，其特征在于将所述的荧光探针用于化学体系、化学模拟生物体系中羟基自由基的检测，生物活细胞和活组织内的羟基自由基的荧光成像检测，以及临床医学上病变组织中羟基自由基的检测。
全文摘要
本发明提供一种检测细胞羟基自由基的荧光探针及合成方法和用途，该方法按如下步骤进行a.取重量浓度为氯金酸溶液150.0体积份加热回流，搅拌下加入柠檬酸三钠溶液5.0－7.0体积份，继续回流10－20分钟，室温下放置冷却，得金纳米粒子溶液；b.将金纳米粒子溶液与5′端修饰荧光素3′端修饰巯基的DNA单链按照1∶200－500物质的量配比混匀，室温下放置1224小时，再用磷酸缓冲液调pH；然后将经调pH值的混合液与物质的量浓度为0.5－5mol/L的氯化钠溶液按照1∶0.1－0.3体积份配比混匀，室温下放置35－45小时；最后经离心，除去上层清液，沉淀溶解于物质的量浓度为0.1－0.3mol/L的磷酸缓冲溶液中，得荧光探针溶液。
文档编号G01N33/53GK101021537SQ200710013008
公开日2007年8月22日 申请日期2007年1月4日 优先权日2007年1月4日
发明者唐波, 张宁, 徐克花, 禚林海, 陈蓁蓁 申请人:山东师范大学