专利名称：一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法
技术领域：
本发明涉及一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，以 提高细胞移植修复组织损伤的效能。。
(二)
背景技术：
热休克蛋白(heat shock protein, Hsp )是一类在生物进化过程中高度
保守并广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。热休克蛋白是一个多基因 家族，其中不同基因的产物在细胞中的表达、功能和定位都有不同。热休 克蛋白在机体内作为分子伴侣，参与维持蛋白的正常折叠以形成蛋白的正 常结构，并在调节蛋白合成与降解的平衡及蛋白定位中起着重要的作用。 当细胞受到环境的各种刺激时，细胞内热休克蛋白的表达增加，能快速短 暂地保护细胞对抗内源性应激的进攻，增强细胞的修复功能以及提高细胞 对应激的耐受程度。
热休克蛋白90 (Hsp90)是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一，影响 着细胞内许多信号转导蛋白的正常功能发挥。研究发现，Hsp90对肿瘤发 生发展起着重要作用，已成为治疗肿瘤的新靶位。热休克蛋白通常被认为 是细胞生存因子，在细胞凋亡发生过程中，Hsp90可以通过阻止 procaspase-9与Apaf-l凋亡体的结合而抑制凋亡的发生。这些发现提示分 子伴倡的作用就像是个分界点，它引导感受到外界应激作用的细胞的走向 生存或是死亡。在细胞发生凋亡前，Hsp90允许细胞暂时休整，并动员细 胞本身的能力对应激诱导的损伤进行修复,这个作用有点类似于细胞周期 中的4企测点。细胞移植治疗修复组织损伤是目前新兴的医疗领域热点。细胞疗法是 对传统医学的一种补充手段，为某些难治性疾病的治疗提供新的希望。干 细胞是一种能自我复制无限增殖,在特定的诱导条件下向同胚层或其他胚 层细胞分化的祖细胞。大量基础实验发现，骨髓千细胞移植能改善心肌梗
死后心功能，延緩心室重构。通过20个临床研究荟萃分析，显示骨髓来 源的干细胞移植能提高左室射血分数3.66% (95%CI为1.93%~5.40%, PO.OOl)。有研究发现，细胞移植后4小时存活的细胞仅占20%,但在 24小时后细胞存活不到10%,细胞移植7天后存活的细胞少之又少。通 过优化细胞种类、移植途径、移植时间等方法能改善干细胞移植的疗效， 此外还可以通过提高移植细胞抗凋亡能力和改善移植微环境来获取最大 限度的细胞移植效能。目前已有的技术包括缺氧预处理，药物预处理和基 因转染等。
发明内容
本发明目的是提供一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的预处 理方法，以提高细胞移植修复组织损伤的效能。 本发明采用的技术方案是
一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，所述方法包 括将经传代培养稳定的骨髓间充质干细胞置于Hsp90浓度0.1~20ju mol/L的细胞培养基中，缺氧培养24 36小时，获得处理后的骨髓间充质 干细胞用于细胞移植。所述细胞培养基为常规用于骨髓间充质干细胞体外 培养的培养基，并且不添加血清，如低糖DMEM液体培养基等，培养温 度为常规适用于骨髓间充质干细胞的培养温度，只是本发明在培养基中添 加了 Hsp90,其添加浓度为0.1 20jumol/L,优选l~10|amol/L,最优选 为10iamol/L;所述缺氧培养是指在没有氧气存在下进行培养，通常可在氮气、二氧化碳或者氮气与二氧化碳混合气的氛围下进行培养。所述传代 培养按常规方法在常规氧浓度(即常氧培养)条件下进行，通常的，所述
常氧培养为在0)2体积浓度5%、 02体积浓度95%的混合气体中培养。 本申请发明人发现，在细胞移植术前，Hsp90预处理能激发细胞内源 性保护机制，通过细胞内多条信号传导通路，增强细胞抗凋亡能力。研究 发现，Hsp90预处理(培养基中终浓度为0.1~20pmol/L,其中以10)amol/L 时作用最强)能提高骨髓间充质干细胞内Akt和ERK磷酸化水平，降低 SPAK/JNK磷酸化水平，从而降低骨髓间充质干细胞内前凋亡蛋白例如 bax的表达，诱导细胞表达抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡执行蛋白 Caspase-3的表达。Hsp90预处理尚能促进细胞合成和分泌一氧化氮(Nitric oxide, NO),减少缺氧无血清诱导的细胞凋亡，Hsp90预处理的细胞移 植到急性心肌梗死局部能提高移植细胞的存活率，改善心功能，增强细胞 移植的效能。
具体的，所述方法如下将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37°C 下在Hsp90浓度10 ju mol/L的低糖DMEM培养基中缺氧培养24小时， 获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
Hsp90包括四个亚单位Hsp90a、 Hsp90p、 GRP94 、 Hsp75/TRAP1。 本发明中，所述Hsp90优选为Hsp90a( GenBank登录号为CR381646.8 )。
所述缺氧培养是指在缺氧条件下进行培养,具体的，所述缺氧培养为
在C02体积浓度5%、 N2体积浓度95%的混合气体中培养。
具体的，所述方法如下将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37°C
下、在C02体积浓度5。/。、 N2体积浓度95。/。的混合气体中，于Hsp90a浓
度10|imol/L的低糖DMEM培养基中培养24小时，获得处理后的骨髓
间充质干细胞用于细胞移植。本发明的有益效果主要体现在通过Hsp90预处理，可有效提高骨 髓间充质干细胞的抗细胞凋亡能力，能提高骨髓间充质干细胞移植修复组 织损伤的疗效。
(四)
图1为Hsp90预处理能减少缺氧无血清诱导的细胞凋亡示意图
图2为Hsp90预处理能减少缺氧无血清诱导的凋亡率示意图3为Hsp90预处理能促进细胞合成和分泌一氧化氮(NO)示意图4为Hsp90预处理通过激活细胞内Akt和ERK信号通路，降低SPAK/
JNK磷酸化水平，从而降低细胞内前凋亡蛋白bax表达，诱导细胞表达
抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl，降低凋亡执行蛋白Caspase-3表达的示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围
并不仅限于此
实施例1:
1. 无菌条件下从合适的健康志愿者(排除造血系统疾患)(王某某，25 岁，来自杭州，本人同意将骨髓捐献供研究使用)的髂后上棘抽取骨 髓液50mL,放置于预先添加4000IU肝素的无菌玻璃瓶中，充分混匀 避免骨髓液凝固，移至层流室生物安全拒进行下一步操作。
2. 将等量低糖DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)(添加100U/mL 青霉素和100U/mL链霉素)加入放置骨髓液的无菌玻璃瓶中稀释骨髓 液，用无菌移液器充分吹散骨髓细胞。
3. 按照密度梯度分离法分离骨髓单个核细胞。在50mL无菌离心管中加 6入20mL淋巴细胞分离液(密度是1.077士0.001 g/mL，购自上海恒信化 学试剂有卩艮公司)，将20mL骨髓液轻轻叠加在淋巴细胞分离液表面。 在高速低温离心机中(Heraeus D-37520,购自德国Thermo Electron 乂> 司)以4。C条件下900g离心25分钟。离心完毕后，细胞分层，从下 至下，可见培养基、白膜层、淋巴分离液和红细胞层。用lmL无菌移 液器收集中间白膜层细胞于另一 50mL离心管中，然后加入20mL低 糖DMEM培养基(购自美国GIBCO公司)，漂洗细胞表面残留淋巴 分离液。于4。C条件下900g离心10分钟，弃上清，收集骨髓单个核 细胞。以含10%( v/v )胎牛血清(购自美国GIBCO公司)的低糖DMEM 培养基重悬沉淀细胞，按2《105/0112细胞密度接种至75cn^生长面积 的细胞培养瓶(购自美国Corning公司)，放置于37°C,含5%C02 (空 气体积浓度95% )和饱和湿度的细胞培养箱(Forma3 111,购自美国 Thermo Fisher公司)中，静置48小时后首次换液，以去除不贴壁细胞。 此后每4~5天换液一次，长满80% 90%以上传代。
4. 以含10。/。胎牛血清低糖DMEM培养基进行原代和继代细胞培养，放置 于37。C、 一定湿度的含5。/。C02的混合气体(空气体积浓度95%)中 常氧培养，根据骨髓间充质干细胞贴壁生长的特性，每4 5天更换细 胞培养基，去除非贴壁细胞，不断纯化人骨髓间充质干细胞。继代第 3代时细胞可进行形态学、流式细胞学等细胞鉴定。
5. 将正常氧浓度下培养的继代第3代人骨髓间充质千细胞更换含一定浓 度的人重组Hsp90a (美国assay designs公司，Cat# SPP-776 )的低糖 DMEM培养基(培养基中Hsp90a终浓度为0.1 10 ju mol/L ),继续于 37°C、 一定湿度的含5% (v/v) C02和950/。 (v/v) N2的混合气体中进 行缺氧培养培养处理。缺氧处理在一个能精确调控氧浓度的ProOx-C-chamber系统(购自美国Biospherix, Redfield公司)中进行， 设定氧浓度为不大于0.5%,缺氧时间为24小时。缺氧处理结束后进 行免疫染色、流式细胞学检测、培养上清液比色法和免疫印迹法检测 细胞凋亡及其相关蛋白。
6. 免疫荧光Hoechst33258染色检测细胞凋亡情况加入Hoechst33258(美 国Molecular probe公司)染料于细胞培养液中，避光孵育15分钟。弃 除细胞培养基，以磷酸盐緩沖液PBS ( 1000mL蒸馏水中含8gNaCl， 0.2gKCl， 1.44gNa2HP04， 0.24gKH2PO4, PH 7.2-7.6)沖洗3遍后， 于荧光倒置显微镜(放大400倍，德国Zeiss公司)摄片观察细胞核 内凋亡小体，实验结果见图1,在荧光倒置显微镜下观察Hoechest染 色的细胞(400倍放大)，左图显示在缺氧-缺血清培养24小时后，细 胞核染色体断裂，出现凋亡小体(蓝色亮点)。右图显示Hsp90共培养 24 d、时的细胞在缺氧-缺血清环境下细胞核凋亡小体不明显；
7. 流式细胞学检测细胞表面Annexin-V的表达率反映细胞凋亡率根据 Annexin-V试齐寸盒(美国BD Biosciences/>司)才喿作i兌明书进4亍。以水 PBS緩沖液漂洗细胞两遍后加入结合緩沖液，将细胞密度调整至lx106 个/ml。取100ul细胞悬液(lx105个细胞)移至5ml离心管，加入5ul Annexin-V和5ul PI。充分混合后常温避光孵育15分钟。每个离心管 中加入400ul结合缓冲液， 一小时内在流式细胞仪下读数。该步骤反 复3遍以上，获取每组样本的细胞凋亡率，实验结果见图2。
8. 比色法检测细胞培养上清液NO水平收集细胞培养上清液，应用NO 试剂盒(美国MERCK-Calbiochem公司)；险测细胞分泌NO水平。测 定方法按试剂盒操作说明书进行，绘制标准曲线，根据酶标仪读取的OD值获得相应的NO产量，实验结果见图3。
9.免疫印迹法检测细胞内Akt、 ERK、 SAPK/JNK信号通路蛋白及凋亡相 关蛋白bax、 bcl-2、 bcl-xL和caspase-3的表达改变。
收集的细胞用RIPA buffer ( 50 mM HEPES, pH 7.3， 1% sodium deoxycholate, 1% Triton X画100, 0.1o/oSDS， 150mMNaCl， ImMEDTA, lmMNa3V04， lmMNaF)裂解后，14，000g离心30 min，收集上清 液冻存于-80。C备用。BCA法(Bicinchoninic Acid Assay,购自美国Sigma 公司)测定蛋白浓度。40昭蛋白样品在6 15% SDS-PAGE梯度胶用 Hoefer Mini-Gel system ( Amersham Biosciences, 购自美国Piscataway 公司)电;永分离，用Hoefer Transfer Tank (Amersham Biosciences,美国 Piscataway公司)将蛋白转移至PVDF膜(购自美国BioRad公司)上， 膜置于緩沖液[Tris緩沖盐溶液，含0.1% Tween-20 ( TBS-T )， 7%牛奶， pH7.6]室温下封闭2h,加入相应一抗(1: 1000,购自美国Cell Signaling 公司)于4。C条件下孵育过夜，小鼠抗p-actin( 1: 1000，购自美国Santa Cruz Biotechnology公司)作为蛋白上样对照；膜用0.5% TBS-T洗涤 后室温下与结合碱性磷酸酶的抗兔IgG或抗小鼠IgG抗体(购自美国 Promega公司)孵育2小时，最后TBS-T及TBS洗涤后用BCIP/NBT溶 液显色(购自美国Sigma公司)，扫描后用Adobe Photoshop CS 8.0 软件分析信号，实验结果见图4。
结论Hsp90预处理能通过激活细胞内Akt和ERK信号通路， 抑制细胞内SAPK/JNK通路，抑制细胞内前凋亡蛋白bax表达降低， 抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-xl表达增高，降低凋亡执行蛋白Caspase-3的表达，同时提高细胞合成NO。实验结果显示，Hsp90在10umol/L时 预处理抗细胞凋亡的作用最强。Hsp90预处理能提高细胞在缺血缺氧 的心肌微环境中抗凋亡能力
权利要求
1.一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，所述方法包括将经传代培养稳定的骨髓间充质干细胞置于Hsp90浓度0.1～20μmol/L的细胞培养基中，缺氧培养24～36小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37°C下在Hsp90浓度10 in mol/L的低糖DMEM培养基中缺氧培养24小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
3. 如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述Hsp90为Hsp卯a。
4. 如权利要求1或2所述的方法，所述缺氧培养为在C02体积浓度5%、N2体积浓度95%的混合气体中培养。
5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法如下将继代第3代的骨髓间充质干细胞于37。C下、在C02体积浓度5%、 N2体积浓度95%的混合气体中，于Hsp90a浓度10 ja mol/L的低糖DMEM培养基中培养24小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。
全文摘要
本发明提供了一种增强骨髓间充质干细胞移植后存活率的处理方法，所述方法包括将经传代培养稳定的骨髓间充质干细胞置于Hsp90浓度0.1～20μmol/L的细胞培养基中，缺氧培养24～36小时，获得处理后的骨髓间充质干细胞用于细胞移植。本发明的有益效果主要体现在通过Hsp90预处理，可有效提高骨髓间充质干细胞的抗细胞凋亡能力，能提高骨髓间充质干细胞移植修复组织损伤的疗效。
文档编号C12N5/08GK101550409SQ20091009799
公开日2009年10月7日 申请日期2009年4月29日 优先权日2009年4月29日
发明者王建安, 谢小洁, 峰 高 申请人:浙江大学