专利名称：：一种可溯源酶校准物质的制备方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种用于检验医学的、具良好互换性的可溯源酶校准物质的制备方法，属于医学检验体外诊断试剂的
技术领域：
。
背景技术：
：酶活力的测定是临床检验中最频繁的测定项目，意义重要。但由于现存的临床检验体系和酶反应的特点，在实际工作中存在很多的问题。首先酶活性浓度的测定是通过间接推算法获得的；其次，影响酶浓度正确测定的因素很多；另外，临床检验中由于检测样本的取样量小，每份样本可能需做多项检验；结果需要及时报告等原因，在一定程度上牺牲了方法特异性和准确性。致使同一种酶存在多种参考范围，各个实验室检测的结果缺乏可比性，病人每到一个医院都要重新化验。重复检测浪费了大量的社会资源。提高和保证临床检验的准确性，使不同方法、厂家、实验室的检验结果具有可比性，检测结果可以溯源，即临床检验标准化，一直是临床检验界及有关行业与部门的重要课题。建立和保证检验结果的溯源性在国际上也已成为法律要求。例如欧盟指令(Directive98/79/EC)/国际标准化组织ISO17511等要求临床检验产品必须保证其结果的溯源性。参考物质需要提供给诊断试剂生产者以使其能够溯源到参考方法。必须将校准物质和质控物质定值的计量学溯源性用于室内质控以及试验系统的评价。图1为从参考物质到常规检测结果的溯源链。显然酶参考物质的应用可以改进方法间的符合程度，使优良检测体系所测定的结果具有溯源性。现在国际的参考物质来自于各种动物或者人的组织，其下一级产品校准物质主要为国外的大公司根据本身产品特点生产，缺乏溯源性分析，不同产品的定值存在矛盾。另外，校准物质的互通性也存在问题，数据显示室间质量评价/能力验证中用到的质控品、校准品也常有基质效应，研制互通性良好、具有溯源性的校准物质是临床检测结果准确性的必要保证。
发明内容本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种可以溯源至国际(国家一级)参考物质的与人各种血清标本具良好互换性的酶校准物质，用于临床检验中常规诊断试剂的校准物质的配备以及医院的日常质量控制；为完成整个溯源链的建立提供技术支撑，促进中国医学检验事业的规范发展的可溯源酶校准物质的制备方法。本发明通过如下技术方案完成可溯源酶校准物质的制备方法包括1、人源性血清酶基因克隆以及表达；2、高纯度基因重组血清酶的纯化；3、互换性良好的基质物质制备；4、校准物质候选物互换性验证；5、分装后均一性测定；6、冷冻干燥。所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达。所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶。所述的互换性良好的基质物质制备是以健康人血清为基质原料制备各种血清酶的校准物质，希望得到与临床各种血清样本互换性好的较准物质；它包括基质物质制备和酶血清基质物质评估。所述的校准物质候选物互换性验证主要包括血清基质成分酶标准物质和校准物质候选物互换性分析所述的分装及均一性测定，它是在无菌条件下，以经过计量的移液枪进行定量分装，分装后随即取样20瓶，用cfas作为校准品，采用Roche-7170系统常规方法进行测定；分别测定20瓶样本的混合瓶样本以及单瓶样本；其中混合瓶样本测定40次，单瓶样本各测定2次。经过统计后确定分装样本是否均匀；所述的冷冻干燥是在确认样本均一性良好的基础上，于-80。C预冻10小时，立即转入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，完毕后进行在位压盖并于-20。C下保存。本发明克服了现有技术存在的不足，具有方法可靠，用途广泛，有良好互换性和可溯源性等特点。具体实施例方式下面将结合具体实施例对本发明作详细的介绍可溯源酶校准物质的制备方法包括1、人源性血清酶基因克隆以及表达；2、高纯度基因重组血清酶的纯化；3、互换性良好的基质物质制备；4、校准物质候选物互换性验证；5、分装后均一性测定；6、冷冻干燥。所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达。所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶。所述的互换性良好的基质物质制备是以健康人血清为基质原料制备各种血清酶的校准物质，希望得到与临床各种血清样本互换性好的较准物质；它包括基质物质制备和酶血清基质物质评估。所述的校准物质候选物互换性验证主要包括血清基质成分酶标准物质和校准物质候选物互换性分析所述的分装及均一性测定，它是在无菌条件下，以经过计量的移液枪进行定量分装，分装后随即取样20瓶，用cfas作为校准品，采用Roche-7170系统常规方法进行测定；分别测定20瓶样本的混合瓶样本以及单瓶样本；其中混合瓶样本测定40次，单瓶样本各测定2次。经过统计后确定分装样本是否均匀；所述的冷冻干燥是在确认样本均一性良好的基础上，于-80。C预冻10小时，立即转入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，完毕后进行在位压盖并于-20。C下保存。实施例以肌酸激酶为例一.人源性血清酶基因克隆以及表达1.肌酸激酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以人肌肌酸激酶全长的cDNA(Genbank:NM-001824)为模板，分别设计肌酸激酶上、下游引物，上游弓I物为GATTATTCATATGCCATTCGGTAACACC;下游引物为AAGGATCCTACTTCTGGGCGGG;用相应的引物扩增出目的片段后，用Ndel和BamHI双酶切后，克隆至pET21b质粒中，构建表达载体pET21b-HMCK。分别用单酶切以及多种双酶切进行鉴定，并测序，与预期结果一致。2.蛋白质优化表达将构建好的表达载体转至BL21菌种中，于含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养，37'C振荡培养至细菌生长到OD值0.60.8时，加入IPTG至终浓度至0.1~0.8mM，发现大量的包涵体，进行优化表达后，得到相对高量的肌酸激酶产物。二、高纯度基因重组血清酶的纯化1.通过主要的三个反应步骤完成肌酸激酶的高纯度蛋白。分级分离将超声破碎后的上清首先经过37%硫酸铵对肌酸激酶蛋白质粗提液进行分级分离，得到纯度约60%以上的初级产物。阴离子交换层析将以上初级产物上样至DEAEfastflow阴离子交换柱中，0~0.6M的NaCl梯度进行梯度洗脱，对洗脱组分进行分步收集，测定CK的活性，收集具有CK活性的、纯度>95%的样品用PEG20000进行浓縮(10ml左右)。分子筛凝胶层析洗脱后，收集具有CK活性的蛋白样品，行SDS-PAGE电泳，收集纯度>99%的样品用PEG20000进行浓缩。结果发现纯度最高的肌酸激酶在SDS-PAGE电泳己经看不到任何杂带。蛋白为单一条带，纯度大于99%。2.测定并去除杂酶用常规的生物化学方法测定其他酶例如丙氨酸转移酶、天冬氨酸转移酶、碱性磷酸酶、Y-谷氨酰转移酶、乳酸脱氢酶含量，未见有明显的杂酶存在。以此高纯度的肌酸激酶作为两种基质参考物质的添加物。三、互换性良好的基质物质制备本发明以健康人血清为基质原料制备各种血清酶的校准物质，希望得到与临床各种血清样本互换性好的较准物质。1.基质物质制备由于酶特性的差别，每一种酶的基质物质制备方法略有差异。肌酸激酶血清基质物质制备方法如下选择健康献血志愿者(HBsAg，HCV抗体、HIV抗体阴性)样本，筛选肌酸激酶活性在正常值范围内的样本，作为基质物质制备的原料。将已经筛选的血清…去颗粒…去脂--稳定性…测试分析主要成分等几个歩骤后确定最后的基质物质。2.肌酸激酶血清基质物质评估分别评价血清基质物质的重要生化指标总蛋白、白蛋白、各种血清酶的活力、常见离子K、Na、Cl、Ca、Mg、P浓度，并与正常的血清进行比较。最后以最接近正常血清指标，且澄清度、稳定性高的基质物质2作为参考物质制备的候选血清基质物质。基质物质2与原血清成分的比较见表1。表12种血清基质物质与原血清成分的比较<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>CI90mmol/L93.1/90.8mmol/L92.5mmol/LCa1.87mmol/L2.02/1.87mmol/L1.92mmol/LMg0.8mmol/L0.94/0.88mmol/L0.81mmol/LP1.49mmol/L1.40/1.43m歸l/L1.46mmol/L四、校准物质候选物互换性验证1.血清基质成分肌酸激酶标准物质将高纯度的肌酸激酶，稀释2000倍左右，分别添加至血清基质成分中，使肌酸激酶标准物质的酶浓度范围在250IU/L左右，即为正常人范围的2倍左右。2校准物质候选物互换性分析分别用IFCC参考方法和4种常规方法对同样的样本进行测试，比较肌酸激酶校准物质与各种血清样本的互换性。测定方法-CK候选参考物质20次/每份，l类对照物质正常人以及患者标本。2次/份；2类对照物质国际参考物质ERM;3次/份3类对照物质Olympus校准品、Roche高、低值质控血清、Cfas2次/份。表2是以IFCC参考方法以及常规方法在7170全自动生化分析仪分别用Roche和Olympus系统测试以上各种样本的结果。7600全自动生化分析仪分别用Roche和Olympus系统测试以上各种样本的结果略。表2IFCC方法与两种常规方法检测各种样本的结果编号IFCC/SD/CVRoche7170/SD/CV01vm應7170/ERM102.0/0.91924/0.9097.3/0.91924/0.95102.5/0.6364/0.62Roche质柠471.4/0.07071/0.02454.6/2.286545/0.50486.9/3.275664/0.67Roche质柠156.9/1.27279/0.81153.0/0.98995/0.65157.9/0.77782/0.49Roche校准345.3/0.56569/0.16333.0/1.83848/0.55352.4/1.41421/0.40Olvmmis校156.7/0.28284/0.18154.1/0.28284/0.18148.2/0.77782/0.53HERUM-CK257.9/2.31121/0.90256.0/1.05177/0.40271.2/1.40536/0.50158.4/0.35355/0.6157.6/0.49497/0.8661.0/0.70711/1.16259.3/0.28284/0.4850.3/0.14142/0.2853.0/0.98995/1.873218.5/0.49497/0.23172.7/1.69706/0.98186.7/0.14142/0.08470.8/0.70711/1.0064.3/0.21213/0.3368.1/0.70711/1.047565.0/0.14142/0.2254.7/1.13137/2.0757.3/0.21213/0.37683.2/1.41421/1.7062.0/0.6364/1.0365.7/0.6364/0.97779.3/0.84853/1.0767.7/1.83848/2.7271.4/0.6364/0.89895.6/0.35355/0.3785.1/0.84853/1.0089.9/0.91924/1.02995.2/1.20208/1.2690.2/1.06066/1.1894.7/0.42426/0.451096.3/0.63640/0.6688.7/0.91924/1.0493.3/0.21213/0.2311101.6/1.69706/1.6775.5/0.77782/1.0377.8/0.07071/0.0912104.7/0.4142/0.1494.1/0.21213/0.2399.0/1.06066/1.0713167.3/0.07071/0.04126.9/1.3435/1.06133.1/1.48492/U214127.8/0.49497/0.39124.6/1.3435/1.08131.1/0.91924/0.7015118,4/1.3435/0.14101.0/1.06066/1.05100.8/1.48492/1.4716258.0/0.84853/0.33230.9/2.47487/1.07245.7/2.47487/1.0117238.7/1.20208/0.50226.1/1.69706/0.75239.1/1.62635/0.6818214.5/0.91924/0.4382.6/2.54558/1.39194.2/2.47487/1.2719137.1/0.28284/0.21〗30.7/1.06066/0.81135.9/0.91924/0.6820139.6/0.21213/0.15115.8/1.41421/1.22121.8/0.84853/0.7021214.1/0/0.00221.6/0.49497/0.22241.0/0.35355/0.1522226.6/0.49497/0.22217.0/0.35355/0.16234.9/1.55563/0.6623207.9/0.49497/0.2497.4/0.84857/0.43212.7/1.69706/0.8024242.2/0.07071/0.03231.2/0.07071/0.03247.2/0.91924/0.3725240.5/1.3435/0.56231.4/1.48492/0.64249.7/0.6364/0.2526298.5/0.42426/0.14286.3/0.6364/0.22311.5/1.06066/0.3427329.6/1.41421/0.43317.4/0.49497/0.16340.2/1.06066/0.3128394.7/1.06066/0.27378.4/0.42426/0.11412.9/0.14142/0.03.29368.2/0.49497/0.13365.1/1.69706/0.46402.1/1.06066/0.26301350.0/5.79829/0.431357.8/2.96985/0.221414.7/4.73762/0.3331394.9/0.21213/0.05384.6/3.25269/0.85409.4/4.17193/1.0232423.7/0.35355/0.09401.5/0.84853/0.21433.3/1.48492/0.3433526.7/1.3435/0.26495.2/0.2〗213/0,04543.2/1.41421/0.2634565.8/0.77782/0.14561.0/0.84853/0.15571.4/2.75772/0.4835638.0/2.96985/0.47608.8〃細36/1.15673.3/0.84853/0.1336672.1/0.70711/0.11667.1/3.33345/0.35707.9/5.44472/0.7737741.7/2.47487/0.33713.6/1.48492/0.21771.8/3.53553/0.4638989.6/3.18198/0.321019.4/5.72756/0.561071.9/2.82843/0.2639178.5/1.41421/0.79176.2/0.84853/0.48187.1/2.33345/1.2540215.7/1.06066/0.49206.6/0.56569/0.27222.2/0.49497/0.22评估方法按照国际通行的有关文件EP-9对参考方法和2台7170、7600生化仪的4种常规方法(Roche/OLYMPUS系统)的做方法学比较。以IFCC参考方法测试的结果与各种常规方法测试结果作图，判断两种方法的回归方式，并求出方程。具体结果见以下的图表。用IFCC的参考方法和4种常规方法对血清样本进行测试后的回归曲线显示本实验肌酸激酶较准物质候选物的测试结果均可落在回归曲线上，即肌酸激酶候选物与血清样本有很好的互换性。五、分装及均一性测定在无菌条件下，以经过计量的移液枪进行定量分装，分装后随即取样20瓶，用cfas作为校准品，采用Roche-7170系统常规方法进行测定。分别测定20瓶样本的混合瓶样本以及单瓶样本。其中混合瓶样本测定40次，单瓶样本各测定2次。经过统计后确定分装样本是否均匀。六、冷冻干燥确认样本均一性良好的基础上，于-80。C预冻IO小时，立即转入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，完毕后进行在位压盖并于-20。C下保存。权利要求1、一种可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于它包括1、人源性血清酶基因克隆以及表达；2、高纯度基因重组血清酶的纯化；3、互换性良好的基质物质制备；4、校准物质候选物互换性验证；5、分装后均一性测定；6、冷冻干燥。2、根据权利要求1所述的可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达。3、根据权利要求1所述的可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶。4、根据权利要求1所述的可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于所述的互换性良好的基质物质制备是以健康人血清为基质原料制备各种血清酶的校准物质，希望得到与临床各种血清样本互换性好的较准物质；它包括基质物质制备和酶血清基质物质评估。5、根据权利要求1所述的可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于所述的校准物质候选物互换性验证主要包括血清基质成分酶标准物质和校准物质候选物互换性分析。6、根据权利要求1所述的可溯源酶校准物质的制备方法，其特征在于所述的分装及均一性测定，它是在无菌条件下，以经过计量的移液枪进行定量分装，分装后随即取样20瓶，用cfas作为校准品，采用Roche-7170系统常规方法进行测定；分别测定20瓶样本的混合瓶样本以及单瓶样本；其中混合瓶样本测定40次，单瓶样本各测定2次；经过统计后确定分装样本是否均匀；所述的冷冻干燥是在确认样本均一性良好的基础上，于-80。C预冻10小时，立即转入真空冷冻干燥机内进行冷冻干燥，完毕后进行在位压盖并于-20。C下保存。全文摘要一种可溯源酶校准物质的制备方法，它包括1.人源性血清酶基因克隆以及表达；2.高纯度基因重组血清酶的纯化；3.互换性良好的基质物质制备；4.校准物质候选物互换性验证；5.分装后均一性测定；6.冷冻干燥；所述的人源性血清酶基因克隆以及表达是酶基因表达载体pET21b-HMCK具体构建过程以及蛋白质优化表达；所述的高纯度基因重组血清酶的纯化主要通过三个反应步骤完成酶的高纯度蛋白第一分级分离；阴离子交换层析；第三分子筛凝胶层析；然后测定并去除杂酶；具有方法可靠，用途广泛，有良好互换性和可溯源性等特点。文档编号C12Q1/25GK101532047SQ20091009784公开日2009年9月16日申请日期2009年4月20日优先权日2009年4月20日发明者周海梦,孟凡国,李海龙,胡卫江申请人:嘉兴博泰生物科技发展有限公司