专利名称：一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法
技术领域：
本发明涉及固定化酶技术领域，具体涉及一种用于油脂水解的以纤维素超细纤维膜为固定化载体的固定化脂肪酶的制备方法。
背景技术：
脂肪酶又称甘油三酸酯水解酶，来源于动物、植物及微生物体内，其天然底物为甘油三酸酯。它能催化酯的醇解、酯合成、酯交换、内酯合成及酰胺合成等一系列反应。脂肪酶还具有良好的底物专一性、区域选择性以及立体选择性等特征，使其在外消旋混合物的手性拆分以及药物中间体的不对称合成方面有着极大的应用价值。由于固定化酶具有易于连续生产、酶的稳定性高、反应条件容易控制、产物分离纯化容易和能改善产物品质等一系列优点，脂肪酶在实际生产应用中以固定化酶的形式为主。固定化酶技术能有效提高酶的稳定性和重复使用性，然而，固定化酶与载体间的一些非生物特异性相互作用也常常导致酶活性的降低。 一些天然物质如多糖、蛋白质、脂类由于具有良好的生物相容性而被广泛地用作酶固定化载体。
纤维素是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，价廉且来源充足，具有较好的稳定性，其作为酶固定化载体已有公开报道。例如，陈秀琳用
羧甲基纤维素(CMC)颗粒固定化脂肪酶(陈秀琳，CM-纤维素固定化脂肪酶的研究，《海峡药学》，2005， 17(1): 35);林繁华等人以醋酸纤维素/聚丙烯复合膜为载体固定化脂肪酶，由于活化醋酸纤维素中的羟基较为困难，他们采用物理吸附的方法固定化酶(林繁华等，醋酸纤维素/聚丙烯复合膜固定化脂肪酶的研究，《安徽工程科技学院学报》，2007, 22(3): 16)。以纤维素颗粒或上述平板膜为载体时，载酶量过低(只有大约lmg酶/g载体)，由此造成生产效率低，不利于实际生产应用。
纳米或亚微米尺度纤维素材料具有比表面积大、孔隙率高、结构性能易于调控等特点，是一种具有良好应用前景的固定化酶载体。采用静电纺丝技术制备纤维素超细纤维膜具有快速、简便、重复性好以及可大规模制备等优点。Wang和Hsieh用双酰氯端基化聚乙二醇为偶联剂，以纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶 (Yuhong Wang, You-Lo Hsieh， EnzymeImmobilization to Ultra-Fine Cellulose Fibers via Amphiphilic PolyethyleneGlycol Spacers, J. Polym. Sci. Part A: Polym. Chem., 2004, 42: 4289-4299)。如前所述，活化醋酸纤维素中的羟基较为困难，因而偶联剂的选择是关键工艺。现有工艺所用偶联剂双酰氯端基化聚乙二醇价格昂贵，实际生产难以承受；酰氯极易水解产生酸雾，对环境有害，且进一步增加了环境防治成本。
发明内容
本发明提供一种用于油脂水解的以纤维素超细纤维膜为载体的固定化脂肪酶的制备方法。该方法纤维素超细纤维膜载酶量大，酶保留活性高；避免采用酰氯作为固定化酶偶联剂，因而制备过程简单、成本低、操作安全、环境友好。
一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤
1) 将纤维素溶于二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，配成浓度为20 200 g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
所述纤维素为醋酸纤维素或醋酸丁酸纤维素；所述的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中二甲基乙酰胺与丙酮的体积比为1 2: 1;
2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，制得纤维素超细纤维膜;静电纺丝条件优选纺丝流量0.2 5 mL/h，纺丝电压为10 20 kV，喷头到接收板的距离为10 20 cm;
3) 将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1 3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；氢氧化钾的乙醇溶液的浓度优选0.1 1M;
4) 将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜进行活化，活化过程可以采用的活化剂为环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌；采用上述活化剂的基本原理在于每一个活化剂分子均含有至少2个活性基团，其中一个活性基团与纤维素超细纤维膜上的羟基进行反应，另一个活性基团与脂肪酶含有的氨基进行反应，从而将脂肪酶固定于纤维素超细纤维膜表面，具体的活化方法分别如下
方法一将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37。C下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)冲洗；
方法二将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05 M，pH7.0)冲洗，然后浸入三聚氯氰的二氧六环溶液中，25 。C下反应0.5小时后取出，依次用二氧六环、无水乙醇、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05 M，pH7.0)冲洗；
方法三将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05 M，pH7.0)冲洗，然后浸入对苯醌溶液中，溶剂为体积比l: 4的乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)， 25。C下反应2小时后取出，依次用体积分数20%的乙醇、1M的NaCl水溶液、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)冲洗；
5) 将脂肪酶溶解于磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH 7.0)中，制成1 20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1 3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M, pH7.0)充分洗涤即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶；
所述脂肪酶为可以用于催化酯水解的脂肪酶，常用的例如来源于皱褶假丝酵母C朋c^a n/goy"或南极假丝酵母朋tor"/ca的脂肪酶。
固定化脂肪酶催化油脂水解的活性按照下述方法测定将纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶加入油脂溶液，催化反应一定时间后用高效液相色谱检测油脂溶液中脂肪酸的含量，并据此计算固定化脂肪酶的活性，所述油脂为大豆油、蓖麻油、菜籽油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油和藻类油脂中的一种或混合物。
本发明的优点在于1)静电纺纤维素超细纤维膜具有制备过程快速、简便、重复性好、可大规模生产的优点，用作脂肪酶固定化载体时载酶量、催化效率高；2)选用环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌作为偶联剂，在纤维素超细纤维膜表面固定化脂肪酶过程简单、成本低、操作安全、环境友好，有利于实际生产应用；3)纤维素价廉且来源充足，具有较好的稳定性，作为酶固定化载体有利于降低生产成本。
图1是醋酸纤维素超细纤维膜的电镜照片；
图2是醋酸丁酸纤维素超细纤维膜的电镜照片。
具体实施例方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例l
1)将醋酸纤维素溶于体积比为3: 2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为130g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量lmL/h，纺丝电压为17kV，喷头到接收板的距离为15cm，制得醋酸纤维素超细纤维膜，电镜照片见图1;
3) 将醋酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5 M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4) 将步骤3)得到的醋酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37。C下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)冲洗；
5) 将来源于C""^fe n/gw"的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05 M，pH7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)充分洗涤即得醋酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为22 mg酶/g膜。
将制得的醋酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为228U/g固定化酶。实施例2
步骤同实施例1，但在步骤1)中使用醋酸丁酸纤维素代替醋酸纤维素，载酶量为17mg酶/g膜。醋酸丁酸纤维素超细纤维膜的电镜照片见图2。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为267U/g固定化酶；用于蓖麻油水解，活性为256U/g固定化酶；用于菜籽油水解，活性为268 U/g固定化酶；用于花生油水解，活性为264 U/g固定化酶；用于棉籽油水解，活性为237U/g固定化酶；用于米糠油水解，活性为248U/g固定化酶；用于藻类油脂水解，活性为249U/g固定化酶；用于体积比l: 1的大豆油和蓖麻油的混合油水解，活性为265 U/g固定化酶；用于体积比为1: 1: 1的大豆油、菜籽油和蓖麻油的混合油水解，活性为258U/g固定化酶。实施例3
1) 将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为1: 1的二甲基乙酰胺/丙酮混合液
中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为20g/L的均一溶液，并静置脱除气泡,得到纺丝液；
2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量5mL/h，纺丝电压为10kV，喷头到接收板的距离为10cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3) 将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为1 M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4) 将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙烷中，37。C下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)冲洗；
5) 将来源于C""^^^"tor"/^的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M， pH7.0)中，制成20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为23 mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为274U/g固定化酶。实施例4
1) 将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为2: 1的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为200g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量0.2 mL/h，纺丝电压为20kV，喷头到接收板的距离为20cm，制得醋酸丁酸纤维素超细
9纤维膜；
3) 将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.1 M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4) 将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用无水乙醇浸润，然后浸入环氧氯丙垸中，37。C下反应3小时后取出，分别用无水乙醇和磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)冲洗；
5) 将来源于Ca"^Ja朋torc"c"的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05M， pH7.0)中，制成1 mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为15mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解，活性为240U/g固定化酶。实施例5
1) 将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为3: 2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为130g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；
2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量lmL/h，纺丝电压为17kV，喷头到接收板的距离为15 cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤维膜；
3) 将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5 M的氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干待用；
4) 将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05M， pH7.0)冲洗，然后浸入三聚氯氰的二氧六环溶液中，25。C下反应0.5小时后取出，依次用二氧六环、无水乙醇、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05 M, pH7.0)冲洗；
5)将来源于Ca"^^z朋tor"/M的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步 骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定 化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维 素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为17mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解， 活性为246U/g固定化酶。 实施例6
1) 将醋酸丁酸纤维素溶于体积比为3: 2的二甲基乙酰胺/丙酮混合液 中，于室温下搅拌溶解，配成浓度为BOg/L的均一溶液，并静置脱除气泡， 得到纺丝液；
2) 以步骤l)中制得的纺丝液进行静电纺丝，纺丝流量lmL/h，纺丝 电压为17kV，喷头到接收板的距离为15 cm，制得醋酸丁酸纤维素超细纤 维膜；
3) 将醋酸丁酸纤维素超细纤维膜置于浓度为0.5 M的氢氧化钾的乙醇 溶液中，浸泡3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗数次，烘干 待用；
4) 将步骤3)得到的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH 7.0)冲洗，然后浸入对苯醌溶液中，溶剂为体积比l: 4的乙醇和 磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)， 25。C下反应2小时后取出，依次用体积 分数20%的乙醇、1 M的NaCl水溶液、去离子水和磷酸缓冲溶液(0.05 M, pH7.0)冲洗；
5) 将来源于C""^^a ""to^"ca的脂肪酶粉溶解于磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)中，制成5mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定 化3小时后用磷酸缓冲溶液(0.05 M， pH7.0)充分洗涤即得醋酸丁酸纤维 素超细纤维膜固定化脂肪酶，载酶量为18mg酶/g。
将制得的醋酸丁酸纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶用于大豆油水解， 活性为251 U/g固定化酶。
权利要求
1、一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，包括以下步骤1)将纤维素溶于二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，配成浓度为20～200g/L的均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；2)以步骤1)制得的纺丝液进行静电纺丝，制得纤维素超细纤维膜；3)将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中，浸泡1～3小时，反应结束后将膜取出并用去离子水冲洗，烘干待用；4)将步骤3)得到的纤维素超细纤维膜用活化剂进行活化；5)将脂肪酶溶解于磷酸缓冲溶液中，制成1～20mg/mL的脂肪酶溶液，离心后取上清液，然后将步骤4)中活化的纤维素超细纤维膜浸入脂肪酶溶液中，室温下固定化1～3小时后用磷酸缓冲溶液充分洗涤即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶。
2、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述纤维素为醋酸纤维素或醋酸丁酸纤维素。
3、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的二甲基乙酰胺/丙酮混合液中二甲基乙酰胺与丙酮的体积比为1 2: 1。
4、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的氢氧化钾的乙醇溶液的浓度为0.1 1M。
5、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)的静电纺丝，纺丝流量0.2 5 mL/h，纺丝电压为10 20 kV，喷头到接收板的距离为10 20 cm。
6、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述活化剂为环氧氯丙烷、三聚氯氰或对苯醌。
7、 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述油脂为蓖麻油、菜籽油、大豆油、花生油、玉米油、棉籽油、米糠油和藻类油脂中的一种或混合物。
全文摘要
本发明公开了一种用于油脂水解的固定化脂肪酶的制备方法，将纤维素溶于二甲基乙酰胺/丙酮混合液中，配成均一溶液，并静置脱除气泡，得到纺丝液；然后进行静电纺丝制备纤维素超细纤维膜；将纤维素超细纤维膜置于氢氧化钾的乙醇溶液中水解生成羟基，用去离子水冲洗数次后再活化羟基；将活化后的纤维素超细纤维膜置于酶液中，反应数小时后即得纤维素超细纤维膜固定化脂肪酶。所制备的固定化脂肪酶可以用于油脂水解。本发明采用纤维素超细纤维固定化脂肪酶，具有工艺简便快速、重复性好、成本低、操作安全、环境友好、适于大规模工业生产的优点，且制得的固定化脂肪酶载酶量大，油脂水解反应催化效率高。
文档编号C12P7/64GK101538566SQ20091009789
公开日2009年9月23日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者万灵书, 徐志康, 赋 黄, 黄小军 申请人:浙江大学