无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及无载体固定化脂肪酶及其制备方法和应用，尤其是无载体固定化米根 霉脂肪酶及其制备方法和生产生物柴油的应用。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（Lipase，EC3. 1. 1.3)，即三酰基甘油酰基水解酶，是一类既可以催化油脂 水解又可以进行转酯化反应的酶。脂肪酶广泛存在于许多动植物及微生物中，尤其在微生 物中有着广泛的分布。目前已知有细菌、放线菌、酵母、丝状真菌共计65个属的微生物产脂 肪酶。绝大多数脂肪酶可以用来催化油脂水解，但只有部分脂肪酶可以用来催化油脂的转 酯化反应。脂肪酶水解油脂后生成游离脂肪酸和甘油、甘油单酯或二酯，其转酯化反应则是 催化甘油三酯与短链醇之间的酯交换反应，生成甘油酯和单链脂肪酸酯（即生物柴油）的 过程。由于脂肪酶催化反应高效、反应条件温和且无毒副产物，所以作为一种重要的工业用 酶广泛应用于食品工业、皮革工业、洗涤工业、医药饲料工业及生物能源等方面。
[0003] 与液体脂肪酶相比，载体固定化脂肪酶具有稳定性强、易于控制和分离、便于运输 和贮存、可实现反复多次使用并且有利于自动化生产等明显优势。
[0004] 中国专利申请CN104087571A以含氢硅油疏水改性的二氧化硅为载体固定脂肪 酶，在具有较高催化活力及良好稳定性的条件下，其重复使用性得到有效提高，重复使用12 次以后，酶活力仍能保持最初的80%以上。
[0005] 中国专利申请专利CN103882004A以纤维素生物质碳化成生物炭基质，采用油酸 分子修饰的纳米凝胶对生物炭基质表面包被，包被后的生物炭基质与脂肪酶溶液接触进而 对脂肪酶进行界面活化与交联固定，冷冻干燥后获得固定化脂肪酶，该方法进行处理的脂 肪酶的催化活性得到大幅度的提高。
[0006] 美国专利申请US5817493利用脂肪酶与含有不可水解有机物成分之间的Si-C化 学键将酶分子固定在一种硅基质上，实现了脂肪酶的稳定高效催化和重复利用。
[0007] 美国专利申请US5508185使用酸性溶液溶解低分子可溶的壳聚糖形，然后使这种 壳聚糖与一种多元醇的缩水甘油醚和酸卤化物反应形成一种多孔的固定化酶载体，脂肪酶 分子通过共价结合与这种载体交联，获得了比游离脂肪酶高出50-60倍的催化效率。
[0008] 目前研宄开发出的这些载体固定化脂肪酶通常具有稳定性好、回收率高和可重复 使用等优点，但是不能很好地满足机械强度高、价格低且易于制备和活化的要求。
[0009] 基于此，技术人员一直在致力于研宄新的脂肪酶固定化方法，以弥补上述不足。
[0010] 中国专利申请CN102154256A公开了一种无载体固定化脂肪酶的制备方法，将扩 展青霉脂肪酶（PEL-CLEA)在硫酸铵沉淀后利用交联剂戊二醛把酶分子交联聚集，来实现 脂肪酶固定化目的。这种无载体固定化脂肪酶虽然具有成本低、易于操作的优点，但是效率 和可重复使用性表现较差。
【发明内容】
[0011] 为了解决现有技术存在的问题，本发明提供一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其 制备方法和应用，通过本发明的制备方法得到的无载体固定化米根霉脂肪酶成本低、催化 效率和可重复使用性表现优异，特别适用于生物柴油的制备。
[0012] 本发明提供的无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法包括以下步骤：
[0013] 1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交 联助剂为血清白蛋白；
[0014] 2)向步骤1)得到的第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀， 静置后得到含米根霉脂肪酶沉淀的第二溶液；
[0015] 3)向步骤2)制得的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵 育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；
[0016] 4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体，即为无载体固定化 米根霉脂肪酶。
[0017] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤1)中，所述米根霉脂肪酶为米根霉脂 肪酶基因转化表达培养液的冻干粉，所述米根霉脂肪酶转化表达培养液通过将米根霉脂肪 酶基因转化到表达载体上培养表达而得。
[0018] 所述米根霉脂肪酶的上述来源为一种优选来源，也可以为现有技术中的已有产 品。上述米根霉脂肪酶基因优选为米根霉Rhizopusoryzae IFO 4697的脂肪酶ROL的基 因，优选地，转化过程中，使用EcoRI和KpnI两个酶切位点将ROL基因连接到载体上。利用 该基因转化表达而制备米根霉脂肪酶的一个优选的实施方式为：提取Rhizopusoryzae IFO 4697的总RNA，以总RNA为模板反转录得到cDNA，设计引物扩增cDNA上的脂肪酶ROL的基 因，然后使用EcoRI和KpnI两个酶切位点将ROL基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZ α上 面，电转化进入毕赤酵母Pichia pastoris Χ33胞内重组表达。在含橄榄油的培养基上挑 取确定有脂肪酶表达的菌落进行发酵产酶培养；收集含有脂肪酶的毕赤酵母发酵培养液， 然后对发酵液进行冻干处理；所述冻干粉即为米根霉脂肪酶冻干粉。
[0019] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤1)中，每毫升缓冲液中含有的米根霉 脂肪酶为30~70mg，所述米根霉脂肪酶与所述蛋白交联助剂的质量比为5~20:1。
[0020] 血清白蛋白，即Serum albumin，常缩写为ALB，是脊椎动物血浆中含量最丰富的球 蛋白。优选为牛血清白蛋白（BSA)，其含607个氨基酸残基，分子量为66. 446kDa，等电点为 4.7。血清白蛋白可以在米根霉脂肪酶转酯化反应中降低醇对于脂肪酶酶活的影响。每毫 升缓冲液中溶入的脂肪酶更优选为40~60mg，进一步优选为45~55mg，所述脂肪酶与所 述蛋白交联助剂的重量比更优选为6~15:1，进一步优选为8~12:1 ;所述缓冲液优选为 磷酸盐缓冲液（K2HPO4-KH2PO4)，优选的浓度为50mM，pH = 7. 0 (米根霉脂肪酶最适pH)。
[0021] 根据本发明所述的制备方法，步骤2)中，乙二醇二甲醚的滴加体积与步骤1)中所 述缓冲液体积的比值为1~3:1，优选为1. 5~2. 5:1。
[0022] 根据本发明所述的制备方法的一个优选实施方式，步骤2)中，4°C条件下搅拌的 同时逐滴加入乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀，静置20-50min。
[0023] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤3)中，所述交联剂以20~60% (v/v) 的交联剂水溶液加入，所述交联剂的终浓度为15~40mM。
[0024] 步骤3)中，更优选地，所述交联剂水溶液的浓度为25 %~50 % (v/v)，进一步优选 为30%~40% (v/v);所述交联剂的终浓度更优选为20~30mM ;将混合溶液放入摇床中孵 育的优选条件为：36~38°C摇床中150~250rpm孵育3~5h。
[0025] 根据本发明所述的制备方法，优选地，步骤4)中，沉淀得到交联酶聚体的方法为： 加入丙酮沉淀，离心除去上清液，再用丙酮洗沉淀而得。
[0026] 步骤4)中，丙酮的加入量与步骤1)中所用缓冲液的体积比为0. 5~3:1，更优选 为0. 7~1. 5:1。优选地，用丙酮多次清洗沉淀。
[0027] 上述方法制得的交联酶聚体即为本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶。
[0028] 本发明提供的所述无载体固定化米根霉脂肪酶的应用涉及脂肪酶在食品工业、皮 革工业、洗涤工业、医药饲料工业及生物能源等方面各种用途，特别涉及在制备生物柴油中 的应用。
[0029] 根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中的应用，优选 地，原料为油脂和醇，制备生物柴油的原料为油脂和醇，所述油脂和醇在所述无载体固定化 米根霉脂肪酶催化作用下发生转酯化反应而生成生物柴油。
[0030] 所述油脂可以为动物油脂、植物油脂或微生物油脂，也可以为混合油脂和废弃油 月旨。根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中的应用，优选地，所述 无载体固定化米根霉脂肪酶与所述油脂的质量比为0. 3~3 :1，更优选为0. 5~2:1，所述 醇包括甲醇和叔丁醇。
[0031] 根据本发明所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中的应用的一个 优选实施方式，操作步骤如下：将油脂和甲醇以醇油摩尔比为2~5:1的比例进行混合，溶 解于其混合溶液1~4倍体积的叔丁醇中，加入上述无载体固定化脂肪酶，摇床中反应。反 应中期可以加入与初始添加量相同的甲醇。10~30h(进一步优选为12~24h)反应结束后 将混合溶液置于分液漏斗中静置分层，取上层相在旋转蒸发仪中，使生物柴油与甲醇和叔 丁醇分离，将蒸馏后的生物柴油置于分液漏斗中收集。其中旋转蒸发仪的温度控制在63~68°C (例如为 65°C )。
[0032] 本发明的有益效果为：本发明的方法制备的无载体固定化米根霉脂肪酶催化油脂 转酯化反应较强，可以用来作为生产生物柴油较为理想的酶制剂。此外，本发明大大增加 了在生物柴油制备过程中脂肪酶在甲醇溶液中的稳定性，并且固定化酶的重复利用率显著 提高。这些有益的效果有赖于本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法的整体优 化，其中涉及的重要技术手段举例如下：使用BSA作为蛋白交联助剂和保护剂，大大增加了 在生物柴油制备过程中脂肪酶在甲醇溶液中的稳定性，并且固定化酶的重复利用率显著提 高；该固定化酶制备方法使用乙二醇二甲醚作为沉淀剂使脂肪酶充分沉淀，比常规使用硫 酸铵沉淀效果更好，能够保持酶活性90%以上；以乙酸酐、甲醛或戊二醛作为交联剂将脂 肪酶交联固定化，与传统固定化酶方法相比优势明显，无需使用固定载体，制备过程简单。
【附图说明】
[0033] 图1为使用实施例2制得的固定化脂肪酶重复实验的结果。
【具体实施方式】
[0034] 下面结合附图以及具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的保护范围并 不限于此。
[0035] 材料和条件说明如下：
[0036] 米根霉 Rhizopusoryzae IFO 4697 和毕赤酵母 Pichia pastoris X33 都为科学研 宄领域流通使用的菌种，在我国本领域相关的主要科研单位（例如福建师范大学）都能获 得并进行培养。文献中也经常提及，例如如下文献：Ting Sun, Wei Du, Dehu