a Liu, Lingmei Dai. Improved catalytic performance of GA cross-linking treatedRhizopus oryzae IF04697whole cell for biodiesel production. 2010, 45 (7):1192 - 1195.
[0037] 缓冲液为磷酸盐缓冲液（K2HPO4-KH2PO 4)，浓度为50mM，pH = 7. 0。
[0038] 交联剂的终浓度为20~30mM。
[0039] 离心条件为 4°C，8000Xg。
[0040] 总RNA提取试剂、反转录试剂以及EcoRI和KpnI均购于赛默飞世尔科技公司；磷 酸盐K2HPOdP KH2PO4、乙二醇二甲醚购于北京化学试剂公司；丙酮、乙酸酐、甲醛和戊二醛购 于北京化工厂；BSA购于中国医药（集团）上海化学试剂公司。
[0041] 生物柴油得率计算公式如下：
[0042]
[0043] 实施例1
[0044] 制备无载体固定化米根霉脂肪酶：提取Rhizopusoryzae IFO 4697的总RNA，以总 RNA为模板反转录得到cDNA，设计引物扩增cDNA上的脂肪酶ROL的基因，然后使用EcoRI 和KpnI两个酶切位点将ROL基因连接到毕赤酵母表达载体pPICZ α上面，电转化进入毕赤 酵母Pichia pastoris Χ33胞内重组表达。在含有橄榄油的培养基上挑取确定有脂肪酶 表达的菌落进行发酵产酶培养。收集含有脂肪酶的毕赤酵母发酵培养液，然后对发酵液进 行冻干处理。将毕赤酵母Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液进行纯化，收集纯化 后含有脂肪酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶冻干粉IOOmg溶解于2mL的磷酸盐缓冲液中，离 心10mim，取上清液加入IOmg小牛血清白蛋白（BSA) ;4°C条件下逐滴加入2mL乙二醇二甲 醚进行脂肪酶的沉淀，静置30min后得到含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入 30% (v/v)的乙酸酐以形成混合溶液，然后将该混合溶液放入37°C摇床中200rpm孵育，在 此混合溶液中加入ImL的丙酮，离心10min，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶 交联酶聚体。
[0045] 转酯化制备生物柴油：取0· 8g菜籽油，加入6g叔丁醇，装于50mL锥形瓶中，振荡 均匀；加入制备好的脂肪酶交联酶聚体Ig ;于Oh和8h分别加入ImL和0. 5mL甲醇，置于 45°C恒温摇床中，转速200rpm的条件下反应24h。反应结束后将混合溶液置于分液漏斗中 静置5~IOmin分层，取上层相在65°C旋转蒸发仪中旋蒸20min，使生物柴油与甲醇和叔丁 醇分离，将蒸馏后的生物柴油置于分液漏斗中收集。离心取上清用气相色谱-质谱联用法 检测。检测结果显示，利用本方法制备的固定化脂肪酶转化油脂生产生物柴油的得率达到 86%〇
[0046] 实施例2
[0047] 制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到毕赤酵母Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液，收集纯化后含有脂肪酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶 冻干粉60mg溶解于I. 5mL的磷酸盐缓冲液中，离心lOmim，取上清液加入6mg小牛血清白 蛋白（BSA) ;4°C条件下逐滴加入2mL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀，静置30min后形成 含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入30% (v/v)的甲醛溶液以形成混合溶液， 然后将该混合溶液放入37°C摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入ImL的丙酮，离心 lOmin，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶交联酶聚体。
[0048] 转酯化制备生物柴油：取一种高产油脂的圆红冬胞酵母 (Rhodosporidiumtoruloides)作为微生物油脂来源，培养、富集和油脂提取；称取这种微 生物油脂〇. 2g加入50mL锥形瓶中，加入5mL叔丁醇，装于50mL锥形瓶中，振荡均勾；加入前 述制备好的固定化脂肪酶交联酶聚体Ig和甲醇ImL，置于45 °C恒温摇床中，转速200rpm的 条件下反应12h，离心取上清用气相色谱-质谱联用法进行检测。检测结果显示，利用本方 法制备的固定化脂肪酶转化来源于R. toruloides的油脂生产生物柴油的得率达到82%。 重复使用实验表明，使用10次之后固定化酶水解酶活保持在80%左右，转酯化酶活保持在 50%左右，结果见图1。
[0049] 实施例3
[0050] 制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到毕赤酵母Pichia pastoris X33表达脂肪酶的发酵液，收集纯化后含有脂肪酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶 冻干粉50mg溶解于ImL的磷酸盐缓冲液中，离心lOmim，取上清液加入5mg小牛血清白蛋白 (BSA) ;4°C条件下逐滴加入ImL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀，静置30min后形成含脂肪 酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入30% (v/v)的戊二醛溶液以形成混合溶液，然后 将该混合溶液放入37°C摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入ImL的丙酮，离心10min， 弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，得到脂肪酶交联酶聚体。
[0051] 转酯化制备生物柴油：取潲水油2g加入250mL锥形瓶中，以醇油摩尔比2:1 (油以 所含的脂肪酸计）加入甲醇3. 2mL，再在混合溶液中添加5mL叔丁醇和前述制备好的固定化 脂肪酶交联酶聚体I. 5g。将反应的锥形瓶置于45°C恒温摇床中，在转速200rpm的条件下 反应6h，之后再次添加入0. 5mL的甲醇继续反应，6h后离心取上清用气相色谱-质谱联用 法进行检测。检测结果显示，利用本方法制备的固定化脂肪酶转化潲水油生产生物柴油的 得率达到80 %，使用10次之后的脂肪酶交联酶聚体转酯化反应的活性保持在62 %~65 %。
[0052] 对比例1
[0053] 制备无载体固定化米根霉脂肪酶：按照实施例1的方法得到由重组毕赤酵母表 达的脂肪酶发酵液，收集纯化后含有脂肪酶的溶液进行冻干处理，脂肪酶冻干粉50mg溶解 于ImL的磷酸盐缓冲液中，离心10mim，取上清液加入5mg小牛血清白蛋白（BSA)，以不加 BSA的脂肪酶作为对照组；4°C条件下逐滴加入ImL乙二醇二甲醚进行脂肪酶的沉淀，静置 30min后形成含脂肪酶沉淀的溶液；在制得的溶液中逐滴加入30% (v/v)的戊二醛溶液以 形成混合溶液，然后将该混合溶液放入37°C摇床中200rpm孵育，在此混合溶液中加入ImL 的丙酮，离心l〇min，弃上清，用预冷的丙酮洗沉淀三次，分别得到含有BSA的脂肪酶交联酶 聚体A和不含BSA的脂肪酶交联酶聚体B。
[0054] 转酯化制备生物柴油：以A和B分别转化实施例1中的菜籽油制备生物柴油，反应 和制备条件均与实施例1相同。实验结果显示，使用交联酶聚体A制备生物柴油的得率达 到86%，而使用交联酶聚体B制备生物柴油的得率只有73%;使用10次之后的交联酶聚体 A的转酯化反应的活性保持在70%以上，而交联酶聚体B的活性只能达到63%。由此可知， BSA作为蛋白助剂能够显著提高脂肪酶交联酶聚体的活性和生物柴油得率。
[0055] 本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技 术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
【主权项】
1. 无载体固定化米根霉脂肪酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： 1) 将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助 剂为血清白蛋白； 2) 向步骤1)得到的第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置 后得到含米根霉脂肪酶沉淀的第二溶液； 3) 向步骤2)制得的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵育，其 中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛； 4) 将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体，即为无载体固定化米根 霉脂肪酶。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述米根霉脂肪酶为米根 霉脂肪酶基因转化表达培养液的冻干粉，所述米根霉脂肪酶转化表达培养液通过将米根霉 脂肪酶基因转化到表达载体上培养表达而得。3. 根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1)中，每毫升缓冲液中含有的米 根霉脂肪酶为30~70mg，所述米根霉脂肪酶与所述蛋白交联助剂的重量比为5~20:1。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2)中，乙二醇二甲醚的滴加体积 与步骤1)中所述缓冲液体积的比值为1~3:1。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述交联剂以20~60% (v/v)的交联剂水溶液加入，所述交联剂的终浓度为15~40mM。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4)中，沉淀得到交联酶聚体的方 法为：加入丙酮沉淀，离心除去上清液，再用丙酮洗沉淀而得。7. -种无载体固定化米根霉脂肪酶，其通过权利要求1~6任一项所述的制备方法制 得。8. 权利要求7所述的无载体固定化米根霉脂肪酶在制备生物柴油中的应用。9. 根据权利要求8所述的应用，其特征在于，制备生物柴油的原料为油脂和醇，所述油 脂和醇在所述无载体固定化米根霉脂肪酶催化作用下发生转酯化反应而生成生物柴油。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述无载体固定化米根霉脂肪酶与所述 油脂的质量比为〇. 3~3 :1，所述醇包括甲醇和叔丁醇。
【专利摘要】本发明提供了一种无载体固定化米根霉脂肪酶及其制备方法和应用。本发明的制备方法包括以下步骤：1)将蛋白交联助剂加入含米根霉脂肪酶的缓冲液中以形成第一溶液，所述蛋白交联助剂为血清白蛋白；2)向第一溶液中加入乙二醇二甲醚以使米根霉脂肪酶进行沉淀，静置后得到含米根霉脂肪酶的第二溶液；3)向的第二溶液加入交联剂以形成混合溶液，然后将该混合溶液孵育，其中，所述交联剂选自乙酸酐、甲醛和戊二醛；4)将步骤3)孵育后的混合溶液进行沉淀以得到交联酶聚体。本发明的无载体固定化米根霉脂肪酶催化油脂转酯化反应较强，重复使用多次后仍保持较强活性。
【IPC分类】C12P7/64, C12N11/18
【公开号】CN104928279
【申请号】CN201510270467
【发明人】黄建忠, 祁峰, 舒正玉, 杨欣伟, 江贤章, 张明亮
【申请人】福建师范大学
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年5月25日