一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物基因工程领域，涉及一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。
【背景技术】
[0002] 大蒜以其丰富的营养价值和独特的辛香味成为调味佳品，我国年产大蒜近700万 吨，出口逾百万吨，遍及140多个国家和地区。联合国粮农组织的资料显示，中国大蒜在全 球大蒜贸易中所占的数量份额高达90%。同时，大蒜还具有很高的药用和保健价值，如杀 菌、抗病毒、降血脂、抗血栓、防治中风和动脉硬化、抗肿瘤等，近年来医药领域对大蒜的药 用价值及其作用机理进行了大量的研宄，使大蒜在医药领域显现出广阔的应用前景。
[0003] 大蒜的风味、医药保健价值要归功于包括蒜素（alliicin)在内的一类巯基化 合物。这类巯基化合物是由蒜氨酸酶（Alliinase)催化一种非蛋白氨基酸一一蒜氨酸 (Alliin)而物形成。在完整的细胞内，蒜氨酸酶和底物是分隔存在的，蒜氨酸存在于细胞 质中，而蒜氨酸酶存在于液泡中。当细胞受伤时，蒜氨酸酶就会从液泡中释放出来，与底物 蒜氨酸相遇，从而催化蒜氨酸产生丙酮酸、氨以及包括蒜素在内的含硫化合物。蒜素很不稳 定，自然条件下就会氧化分解，释放出有臭味的硫化物。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。
[0005] 本发明所提供的大蒜蒜氨酸酶来源于大蒜（Allium sativum L.)，具体是如下（a) 或（b)或（c)所示的蛋白质：
[0006] (a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0007] (b)由序列表中序列1的第30-463位所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0008] (C)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或 添加且具有大蒜蒜氨酸酶活性的由（a)或（b)衍生的蛋白质。
[0009] 其中，序列表中的序列1由463个氨基酸残基组成，其中第1-29位为信号肽序列。
[0010] 为了便于所述蛋白质的纯化，可在所述蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如下 表所示的标签。
[0011] 表：标签的序列
[0012]
[0013]
[0014] 上述（c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。 上述（c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列表中序列2或3所示的DNA序列中缺失一个 或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变。
[0015] 编码所述蛋白质的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0016] 所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以 是 RNA，如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0017] 所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因，所述基因具体可为如下1)-5)中任一所 述的DNA分子：
[0018] 1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0019] 2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0020] 3)序列表中序列2的第88-1392位所示的DNA分子；
[0021] 4)在严格条件下与1)-3)中任一所限定的DNA分子杂交且所述蛋白质的DNA分 子；
[0022] 5)与1)_4)中任一所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码所述蛋白 质的DNA分子。
[0023] 上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0· 1 % SDS 和 I X SSC，0· 1 % SDS 各洗膜一次。
[0024] 其中，序列2由1392个核苷酸组成，为来自于大蒜中的蒜氨酸酶基因，第1-87位 为信号肽的编码基因；序列3由1305个核苷酸组成，为在序列2的第88-1392位的基础上 按照酵母细胞密码子偏好性，在不改变氨基酸序列的前提下进行优化后的蒜氨酸酶基因序 列。
[0025] 含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌也属于本发明的保护 范围。
[0026] 所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0027] 所述重组表达载体既可为用于转化受体酵母的重组酵母表达载体，也可为用于转 化受体细菌的重组细菌表达载体，还可为用于转化受体植物的重组植物表达载体。
[0028] 所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的 3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。 所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端。使用所述基因构建重组表达 载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动 子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载 体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因细胞进行鉴定及 筛选，可对所用表达载体进行加工，如加入可发光化合物的基因（GFP基因、萤光素酶基因 等）、具有抗性的抗生素标记物（庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等）等。
[0029] 在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体为用于转化受体酵母的重组酵母表 达载体，其中启动所述基因转录的启动子为5'AOXl启动子。
[0030] 更为具体的，所述重组表达载体为在PPIC9K载体的多克隆位点处插入所述基因 后得到的重组质粒。所述多克隆位点具体为EcoRI和Not I。
[0031] 所述表达盒由能够启动所述基因表达的启动子，a-factor信号肽序列，Kex2和 Stel3信号肽切割位点，所述基因，以及转录终止序列组成。
[0032] 在本发明中，所述重组细胞具体为含有所述基因的重组酵母细胞；所述酵母具体 可为毕赤酵母。
[0033] 所述蛋白质在作为蒜氨酸酶中的应用也属于本发明的保护范围。
[0034] 所述蛋白质或所述核酸分子或所述重组表达载体、重组细胞、表达盒或重组菌在 制备具有蒜氨酸酶活性的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0035] 序列表中序列3所示DNA分子在提高酵母细胞中蒜氨酸酶表达量中的应用也属于 本发明的保护范围；所述蒜氨酸酶具体为序列表中序列1所示蛋白质。
[0036] 其中，所述"提高"具体为：与序列表中序列2所示DNA分子（优化前）相比，序列 表中序列3所示DNA分子在酵母细胞中表达的蒜氨酸酶的量有所提高。所述酵母具体可为 毕赤酵母。
[0037] 本发明还提供了 一种制备蒜氨酸酶的方法。
[0038] 本发明所提供的制备蒜氨酸酶的方法，具体可包括如下步骤：
[0039] 1)将所述核酸分子或所述重组载体或表达盒导入受体酵母细胞，得到重组酵母细 胞；
[0040] 2)培养所述重组酵母细胞，进行诱导表达，收集并裂解所述重组酵母细胞，获得蒜 氨酸酶；所述蒜氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质；
[0041] 在步骤2)中，所述诱导表达具体可为：向培养有所述重组酵母细胞的培养液中加 入甲醇，维持所述甲醇在所述培养液中的体积百分含量为〇. 5~1 %，28°C -30°c (如28°C ) 培养24-144小时（如72-108小时，如96小时）；所述酵母具体可为毕赤酵母。
[0042] 其中，所述培养为振荡培养，转速为260rpm，振幅20mm。
[0043] 在本发明中，所述毕赤酵母具体为毕赤酵母GS115。
[0044] 本发明提供了一种新的大蒜蒜氨酸酶编码基因，并按照酵母细胞的密码子偏好性 进行了相应的密码子优化，且通过毕赤酵母表达系统验证了基因功能。所得重组酵母细胞 培养24h开始有轻微的蒜氨酸酶酶活，96h酶活达到最高，最高酶活力为183. 72U，比活力为 172. 25U/mg。本发明为利用基因工程技术表达重组蒜氨酸酶提供了更多的基因资源，也为 研宄不同蒜氨酸酶基因对大蒜食用品质的影响提供更开阔的思路。
【附图说明