8] 由于蒜氨酸酶每催化1分子蒜氨酸发生反应会产生2分子丙酮酸，因此可以通过 测定丙酮酸的浓度来推算蒜氨酸酶的酶活。丙酮酸可与2, 4-二硝基苯肼反应，生成丙酮 酸-2, 4一二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈樱红色，在520nm处测定吸光值。
[0099] 2、绘制标准曲线
[0100] 配置120 μ g/ml丙酮酸母液，分别取丙酮酸母液0、0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1.0ml于不 同的试管中，用蒸馏水补足至总体积2ml，使其终浓度分别为0 μ g/ml、12 μ g/ml、24 μ g/ ml、36 μ g/ml、48 μ g/ml、60 μ g/ml，然后每管中加入8% (g/ml，质量体积比）三氯乙酸2mL， 混匀，再加入ImL 0. 1 % (g/ml，质量体积比）2, 4-二硝基苯肼，摇匀。加入5mL I. 5mol/L NaOH，摇匀，静置IOmin显色。取3mL反应液，以丙酮酸浓度为0的反应液为对照，在520nm 波长下对其余各管进行比色。
[0101] 以丙酮酸溶液的浓度为横坐标（X)，以对应的0D520值为纵坐标（y)，绘制标准曲 线。得到标准曲线方程式为y = 0. 0224X+0. 0197, R2= 0. 996。
[0102] 3、定量检测
[0103] 用无菌的蒸馏水溶液配制30mmol/L的蒜氨酸底物（新疆埃乐欣公司产品）。以步 骤三Western blot分析鉴定阳性的两种重组毕赤酵母转化子进行摇瓶培养（具体培养条 件参见步骤三），每隔12h收集酵母表达上清液。
[0104] 在收集齐的上清液中分别加入1.0 mL蒜氨酸底物，30°C下反应5min，而后加入2mL 8%三氯乙酸终止反应。再加入LOmL 0.1 % 2, 4-二硝基苯肼充分反应，加入5mL 1.5mol/ L NaOH溶液摇勾，静置IOmin显色，用752紫外分光光度计在波长520nm处测定吸收值。根 据吸收值及步骤2获得的标准曲线方程算出丙酮酸总浓度及酶活力。进一步以蒜氨酸酶标 准品作为对照，用Lowry法测定溶液中蒜氨酸酶蛋白质量，进而求出所测样品中蒜氨酸酶 的比活力。所谓比活力为单位重量（mg)蒜氨酸酶蛋白质量所具有的酶活力单位数。实验 重复三次，结果取平均值。
[0105] 实验同时设置转入线性化PPIC9K空载体的重组毕赤酵母克隆的上清为空载体对 照，设置未转基因的毕赤酵母作为未转基因对照。
[0106] 结果显示：
[0107] 对于转入线性化pPIC9K-AlliiNl_P质粒的重组毕赤酵母而言，诱导培养12h还检 测不到蒜氨酸酶活性，24h有轻微的酶活，96h酶活达到最高，最高酶活力为183. 72U，比活 力为172. 25U/mg，108h后酶活开始下降。对于转入线性化pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕 赤酵母而言，也是诱导培养12h检测不到蒜氨酸酶活性，24h有轻微的酶活，96h酶活达到最 高，最高酶活力为97. 26U，比活力为166. 52U/mg，108h后酶活开始下降。酶活力和比活力测 定结果具体参见图5和图6。而空载体对照组和未转基因的毕赤酵母组直至实验结束也没 有检测到蒜氨酸酶活性。
[0108] 转入线性化pPIC9K-AlIiiNl-P质粒的重组毕赤酵母组和转入线性化 pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕赤酵母组在不同培养时间的酶活及比活力具体测定结果见 表1。从表1可以直观看出，在相同的培养时间，转入线性化pPIC9K-AlliiNl-P质粒的重 组毕赤酵母组的酶活显著高于转入线性化pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕赤酵母组的酶活 (P〈0.05);但是比活力两组差异不显著。这说明转入线性化pPIC9K-N-AlliiNl质粒的重组 毕赤酵母组表达的蒜氨酸酶的量显著高于转入线性化pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕赤酵 母组，即与优化前（序列2的第88-1392位）相比，优化后的pPIC9K-AlliiNl-P基因（序 列3)显著提高了在毕赤酵母中蒜氨酸酶的表达量。
[0109] 表1转入线性化pPIC9K-AlliiNl-P质粒或pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕赤酵母 在不同培养时间的酶活及比活力具体测定结果
[0110]
[0111] 注："优化前"表示转入线性化pPIC9K-AlliiNl质粒的重组毕赤酵母；"优化后"表 示转入线性化pPIC9K-AlliiNl-P质粒的重组毕赤酵母。不同小写字母之间表示差异显著 (Ρ〈0· 05) 〇
【主权项】
1. 蛋白质，是如下（a)或（b)或（c): (a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b) 由序列表中序列1的第30-463位所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (c) 将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加 且具有大蒜蒜氨酸酶活性的由（a)或（b)衍生的蛋白质。2. 编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为编码权利要求1所 述蛋白质的基因，所述基因为如下1)-5)中任一所述的DNA分子： 1) 序列表中序列2所示的DNA分子； 2) 序列表中序列3所示的DNA分子； 3) 序列表中序列2的第88-1392位所示的DNA分子； 4) 在严格条件下与1)-3)中任一所限定的DNA分子杂交且编码权利要求1所述蛋白质 的DNA分子； 5) 与1)_4)中任一所限定的DNA分子至少具有90%以上同源性且编码权利要求1所 述蛋白质的DNA分子。4. 含有权利要求2或3所述核酸分子的重组载体、表达盒、重组细胞或重组菌。5. 根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组表达载体或重 组克隆载体； 所述重组表达载体中启动所述基因转录的启动子具体为5'AOXl启动子。6. 根据权利要求4所述的重组细胞，其特征在于：所述重组细胞为含有权利要求2或3 所述核酸分子的重组酵母细胞； 所述酵母具体为毕赤酵母。7. 权利要求1所述的蛋白质在作为蒜氨酸酶中的应用。8. 权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5或 6所述的重组表达载体、重组细胞、表达盒或重组菌在制备具有蒜氨酸酶活性的产品中的应 用。9. 序列表中序列3所不DNA分子在提尚酵母细胞中赫氣酸酶表达量中的应用；所述赫 氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质； 所述酵母具体为毕赤酵母。10. -种制备蒜氨酸酶的方法，包括如下步骤： 1) 将权利要求权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5所述的重组载体或表 达盒导入受体酵母细胞，得到重组酵母细胞； 2) 培养所述重组酵母细胞，进行诱导表达，收集并裂解所述重组酵母细胞，获得蒜氨酸 酶； 所述蒜氨酸酶为序列表中序列1所示蛋白质； 步骤2)中，所述诱导表达具体为：向培养有所述重组酵母细胞的培养液中加入甲醇， 维持所述甲醇在所述培养液中的体积百分含量为〇. 5~1%，28-30°C培养24-144小时； 所述酵母具体为毕赤酵母。
【专利摘要】本发明公开了一种大蒜蒜氨酸酶及其编码基因与应用。本发明所提供的蛋白质，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有大蒜蒜氨酸酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本发明还提供了一种新的大蒜蒜氨酸酶编码基因，并按照酵母细胞的密码子偏好性进行了相应的密码子优化，且通过毕赤酵母表达系统验证了基因功能。本发明为利用基因工程技术表达重组蒜氨酸酶提供了更多的基因资源，也为研究不同蒜氨酸酶基因对大蒜食用品质的影响提供更开阔的思路。
【IPC分类】C12N15/60, C12N15/81, C12N9/88, C12R1/84, C12N1/19
【公开号】CN104928273
【申请号】CN201510354253
【发明人】唐巧玲, 王志兴, 王旭静
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年9月23日
【申请日】2015年6月24日