专利名称：：一种蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片的制作方法
技术领域：
：本发明涉及医用药品领域，尤其涉及具有抗幽门螺旋杆菌及白色念珠菌等感染药效的蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片。
背景技术：
：大蒜作为药食两用植物已有悠久历史，近年来我们对其作了深入的研究，得出大蒜中蒜氨酸与蒜酶能产生大蒜辣素和丙酮酸，在这些物质的作用下，具有良好的抗病原细菌、真菌、病毒和抗肿瘤的作用。同时还具有防治心脑血管病的功效，蒜氨酸(Alliin)化学名S-烯丙基-L-半胱氨酸亚砜(S-Allyl-L-cysteine)。熔点163-165°C(分解、炭化)，[a]D=+60°，白色结晶性粉末，几乎无臭。"^^s.<^Y^、OHCsH"N03S.=177,22蒜酶蒜酶(Alliinase，EC4.4.1.4)又名蒜氨酸裂解酶、烷基半胱氨酸亚砜酶、C-S酶、(S-allyl-L-cysteinesulfoxidelyase,Cysteinesulfoxidelyase;Alkylcysteinesulfoxidelyase)。属二聚体糖蛋白，两个亚基分子量均为51.5KDa。结晶呈黄色，无臭，等电点pH-4.9。蒜酶活力(效价)的测定酶活力(效价)单位定义为每分钟裂解l陶ol蒜氨酸相当的蒜酶量，为一个活力单位。蒜酶在适当条件下，具有催化裂解底物蒜氨酸的酶解反应，产生大蒜辣素和丙酮酸，这些酶释反应产物的多少直接与蒜酶的活力(效价)有关。大蒜辣素大蒜辣素(Allicin),化学名二烯丙基硫代亚磺酸酯(2-propene-1-sulfinothioicacidS-2-pr叩enylester)，鲜蒜中原本不含大蒜辣素，由蒜酶与蒜氨酸相遇催化裂解反应产生。是大蒜次级反应产生的最重要的生物活性成分。Mw:162.3。密度1.112g/cm。熔点<25°C。易挥发，具有浓烈气味，微溶于水，化学性质不稳定。<formula>formulaseeoriginaldocumentpage4</formula>蒜酶对蒜氨酸的催化反应如下争j|&細H叫蒜氛睃大蒜辣素丙酮酸盐(醋)蒜酶催化蒜氨酸反应动力学的研究如下蒜酶产品加底物(蒜氨酸)分别配成试液。超声混合30秒，35'C水浴保温。分别于5、15、25min,及1、3、5、7、9、11、13hr吸取反应液适量，加甲醇混匀。过0.45um滤膜，HPLC进样10ul，得到色谱图。计算蒜氨酸、丙酮酸及大蒜辣素含量。绘制酶促反应曲线，如附图1所示。显示蒜酶的特性的反应曲线5分钟以内为酶促反应初速度(呈现一级反应S+E—P。其速度方程为-d[S]/ch^kJS]):25分钟达到最大反应速度(呈现混合级反应E+S—ES—E+P。)。大蒜辣素随时间浓度增加，15分钟至13hr，其浓度基本稳定(25分一13hr接近零级反应)。以上实验情况说明，蒜酶对蒜氨酸的催化反应仅在525分钟内产生，为了使催化反应控制在所需的时间段内，以达到更大的疗效，这是本发明所追求的。
发明内容本发明的目的为提供一种能产生蒜酶对蒜氨酸催化反应的药剂和进一步开发以大蒜为原料，分别提取蒜氨酸及蒜酶，制备治疗幽门螺旋杆菌、白色念珠菌、不动杆菌、耐甲氧西林金葡菌等感染性疾病的药物。实现上述目的的技术方案如下一种抗幽门螺旋杆菌等感染性疾病的二元释药多层片，该制剂分三层组成，中间为隔离层，在隔离层一侧为蒜氨酸与辅料混合层，另一侧为蒜酶与辅料混合层(见附图2a，)，在三层结构外面包有肠溶薄膜或普通薄膜(见附图2b)。包有肠溶薄膜的二元释药多层片为口服用药，包有普通薄膜的二元释药多层片为阴道用药。所述隔离层为羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉等惰性粘结材料，辅料为聚丙烯酸树脂、羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉，及硬脂酸镁等。由蒜氨酸与蒜酶催化作用生成的大蒜辣素对幽门螺旋杆菌、白色念珠菌、耐甲氧西林金葡菌等感染性疾病具有抗菌药效。蒜氨酸/蒜酶抗幽门螺旋杆菌、白色念球菌、不动杆菌、耐甲氧西林金葡菌等的药效实验实验内容(1)、试液蒜氨酸(alliin)与蒜酶(Alliinase)新鲜配制，模拟蒜氨酸/蒜酶二元释药系统新制剂释放大蒜辣素(allicin)。(2)、药效观察采用琼脂(挖孔)扩散法，以便临用时在琼脂孔中同时加入蒜酶和蒜氨酸。按两个分子alliin转化为一个allicin(实际上是1.78个分子)计算，Alliin的每孔加量应为500yg，因此alliin的浓度应是50000mg/L(50g/L)。蒜酶的浓度按1:1计算，亦应是50000mg/L。根据大蒜辣素的药效学文献推算，按每孔allicin250ug设计可能较为合适。琼脂扩散法所挖孔的孔径在3ram6mm皆可，以孔径3醒计算，孔体积约7u1，最大可加10u1，则药液浓度可配成25mg/ml[25000mg/L，(25g/L)]，(3)、加药方法蒜氨酸和蒜酶溶液临时现配，然后等量混合加10ul入孔中(或者各加5ul)。(4)、原液的配制蒜酶和蒜氨酸各配成0.lg/2ml原液(后改为O.lg/4ml)，现配现用。(5)、受试菌的选择选取目前临床上常见的难题菌株，主要包括MRSA、白念、铜绿假单胞菌、不动杆菌，考虑口服给药的情况，加做幽门螺杆菌，沙门菌和志贺菌。试验记录(1)、2007-10-09A液为alliin，0.1g/2ml;B液为蒜酶，0.lg/2ml试验菌各加5ul后的抑菌圈直径(mm)A10ul+B5u1A15ul+B5u1(咖)A10yl+B10u1(mm)MRSAo生长o生长o生长o生长o生长o生长o生长白念30283430343834结论①、MRSA未生长，可见药物浓度太高，建议药物浓度稀释一倍，即各配成0.lg/4mlg液②、AlOy1加B10y1的结果和A10ixl+B5n1的结果基本一样，足见蒜酶的浓度(1:l加量)已足够(实际上已过量)。(2)、2007-10-10实际试验结果因为每孔加上述浓度的药液抑菌圈太大，遂将药物原液改为0.lg/4ml按每孔加两种药液各5u1、10u1、和15u1进行试验<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>(3)、2007-10-12要求对这几个试验菌做MIC，以比较抑菌圈直径与MIC的关系，确定试验的最佳浓度。初步看来，各加5ul已经够了，因为多加一倍或三倍并未显著增加抑菌圈直径。(4)、2007-10-15，MIC测定:A/B各配成0.lg/4ml原液，各取lml加9ml肉汤为第一管，继续倍比稀释至第九管，第十管为无葯对照。加菌液，如常规测MIC。结果沙门在第二管，350ug/ml;痢疾在第三管，175ug/ml白念在第三管，175ug/mlMRSA在第七管，10.95lig/ml(5)、20071006和20071018的结果A/B各配成0.lg/4ml原液，按每孔加两种药液各5y1、10yl、禾ni5ul<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>结论①、各加5H1即可②、大蒜辣素对MRSA效果最好，然后依次为白念、痢疾、沙门氏菌。③、对于细菌而言，抑菌圈结果与MIC结果较一致的是孔中各加lOjxl，其对应结果见下表；白念的MIC结果与扩散法结果不太一致(采用扩散法，孔中各加5"1和10!U，或许对于评价痢疾与白念之间的差异较好)。药敏方法MRSA白念抑菌圈均值mm34.5830.17MIC(ug/m丄)10.95175大蒜辣素对幽门螺杆菌(Hp)的药效观察(7)、2007-12-25，Hp标准株的检测结果(72h培养)孔中A、B两液的加量ATCC43504ATCC700824抑菌圈直径(mm)抑菌圈直径(mm)5322874138104341(8)、2007-12-28，临床分离株72h培养的药敏结果孔中A、B两液的加量(u临床菌株编号1)07121401071217010712180107121702518394532726505443(9)、2007-12-29结果(48h培养)0712210307122105071221045ul25.022.026.0小结大蒜辣素对Hp有较高的抗菌药效，以A、B药液各5pl加量的实验结果进行统计，平均抑菌圈直径为29.7mmU845mm)，推算其MIC值约为29.96mg/L.结论蒜氨酸、蒜酶二元释药系统对耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)、不动杆菌、大肠埃希菌、幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌(白念)等具有明显的杀菌活性，其中以MRSA和幽门螺杆菌最为敏感。其MIC值约在1030mg/L;其次白念对大蒜辣素的敏感性亦较高。蒜氨酸、蒜酶二元释药系统有望替代万古霉素成为治疗MRSA感染的重要药物；可用于治疗幽门螺杆菌引起的胃炎和胃溃疡；蒜氨酸、蒜酶二元释药系统亦可作为酵母样真菌感染的治疗药物(内服或外用)。7图1是酶促反应曲线(催化动力学曲线)图2a为二元释药多层片侧面视图(其中10表示蒜酶，30表示蒜氨酸，20表示隔离层)图2b为带有包衣的二元释药多层片侧面视图(其中40表示包衣)。图3是HPLC色谱图(l.蒜氨酸、2.内标)图4是蒜酶垂直平板电泳及图(PowerPac1000，BIO-RAD)(泳道l:Mark;泳道2、3、4:蒜酶)具体实施例方式实施例1隔离层20克蒜氨酸与辅料混合层蒜氨酸100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁0.5克蒜酶与辅料混合层蒜酶100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁1克制备方法如下(1)蒜氨酸与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用；(2)蒜酶与辅料混合层的组成物料混匀分成1000份备用；(3)采用ZPD25多功能压片机，圆凸型冲模，干粉压片法。在压片机上装冲模，取一份蒜氨酸与辅料混合层的混匀物料放入冲模中，作为下层，加压；将隔离层物料的千分之一量加在上面，再加压；取一份蒜酶与辅料混合层混匀物料加在隔离层上面，再加压；成三层片，出模；(4)在每片三层片外面包肠溶衣；(5)共制成1000片成品药。制成的包肠溶衣三层片的示意图如图la和图lb所示，IO表示蒜酶与辅料混合层，20表示隔离层，30表示蒜氨酸与辅料混合层，40表示肠溶衣或普通薄膜包衣材料。实施例2各组成物料的重量配方如下隔离层50克蒜氨酸与辅料混合层蒜氨酸100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁0.5克蒜酶与辅料混合层蒜酶100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁1克制备方法同实施例1实施例3各组成物料的重量配方如下隔离层40克蒜氨酸与辅料混合层蒜氨酸100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁0.5克蒜酶与辅料混合层蒜酶100克辅料(1)羟丙甲纤维素或乳糖或淀粉8克(2)硬脂酸镁l克制备方法同实施例1蒜氨酸的制备在中国发明专利CN1157373C、专利号为ZL00101244.4的"从大蒜中提取蒜氨酸的方法"以及中国发明专利CN1203057C、专利号为ZL03100420.2"从鲜蒜中提取蒜氨酸生产工艺"两项发明专利的基础上。以新疆大蒜为原料，蒜瓣经蒜酶灭活、萃取、离子交换柱吸附、氨水洗脱浓縮、重结晶等步骤得到蒜氨酸原料药，蒜氨酸含量》90%。蒜氨酸原料药的含量测定蒜氨酸原料药的含量必需大于90%。测定方法以利巴韦林为内标物，高效液相色谱法(Agilent1100)测定蒜氨酸原料药种蒜氨酸的含量。精密称取蒜氨酸对照品20mg，置50ml容量瓶，纯水溶解、定容至刻度。精密移取0.50ml、2.50ral、5.OOml、7.50ml、10.Oml、12.5ml分别置25ml容量瓶中，各加入2.00ml利巴韦林内标液(0.4mg/ml)，水定容至刻度。在波长220咖处测定，校正因子(f)为0.5559，RSD=1.8%(n=6)，日内精密度为0.6%(n=5)。曰间精密度RSD4.3y。(n=5)。测定五批蒜氨酸供试品的蒜氨酸含量》90%。HPLC色谱图如附图3所示。蒜酶的制备在中国发明专利CN1222613C、专利号为ZL03100419.9的"从鲜蒜中提取蒜酶生产工艺"的基础上，设计在低温车间(0-5'C)，鲜蒜经精选、冷却、脱皮、纯水清洗、胶体磨破壁打浆、缓冲-保护液萃取、盐析、超滤、冷冻干燥等步骤，制备蒜酶。蒜酶活力(效价)的测定酶活力(效价)单位定义为在最佳底物(蒜氨酸)、最佳浓度、最佳温度(35°C)、最佳pH(7.0)条件下，每分钟裂解l陶ol蒜氨酸相当的蒜酶量，为一个活力单位。依据蒜酶催化裂解底物蒜氨酸的酶解反应，采用高效液相色谱法(HPLC)测定蒜氨酸的减少量，计算蒜酶原料药的活力。经测定，五批蒜酶原料药供试品酶活力为^1000U/g。效价(单位/。=_驗酸齡iC竭)_丽、平"蒜氨酸分子量x反应吋间(mm)x供试品取样量〔mg)蒜酶纯度与分子量的测定采用SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS—PAGE)测定蒜酶纯度及相对分子量。采用图像分析仪成像(图5)，并分别量取指示剂移动的距离、Mark移动的距离、蒜酶移动距离计算分子量(表5)。蒜酶浓度lmg/ml时仅呈现一带。蒜酶垂直平板电泳及图(PowerPac1000，BIO-RAD)，其中泳道l:Mark;泳道2、3、4:蒜酶以标准蛋白质分子量的对数lgMr对其相对迁移率Rf进行线性回归，得回归方程lgMr=-l.3077Rf+2.4917，=0.993710将蒜酶样品的相对迁移率Rf代入回归方程计算得蒜酶亚基分子量为54.0kDa。蒜酶由两个相同的亚基组成，蒜酶分子量为108kDa。蒜酶垂直平板电泳及图(PowerPacl000,BI0-RAD)(泳道l:Mark;泳道2、3、4:蒜酶)见附图4。蒜氨酸/蒜酶二元释药系统的理论依据蒜酶催化蒜氨酸反应动力学在适当条件下蒜酶迅速催化裂解蒜氨酸，产生大蒜辣素等系列硫化物。反应条件蒜酶与蒜氨酸按制剂配方规定比例(1:2-0.5)混合。加适量磷酸盐缓冲液(pH=7.8，模拟肠道环境)，超声30秒溶解混匀，35-4(TC保温(模拟体温)，在0、5、15、25、60min及l、3、5、7、9、11、13hr分别测定蒜氨酸、大蒜辣素及付产物丙酮酸含量。得到催化动力学曲线。米氏常数Km=3.6mmo1，最大反应速度Vmax-27.9umol、g—'。显示蒜氨酸/蒜酶二元释药系统设计的科学性及可行性。既实现了药物制剂的稳定性，又保证了药物的有效性。本发明片剂由蒜氨酸层、隔离层及蒜酶层组成，外包肠溶衣。蒜氨酸/蒜酶重量配比为1:1，蒜氨酸标示量为100mg/片。潜在大蒜辣素含量65mg/片。片中原料药重量占75%-80%，辅料重量占20%-25%。蒜氨酸极易溶于水，蒜酶加水形成胶体，并且对温度敏感。不宜湿法制粒。蒜酶、蒜氨酸对热敏感，蒜酶干粉温度超过45t:，每小时活力减低10%，蒜氨酸干粉温度超过85'C，每小时含量降低2%，因此应在低温车间干粉直接压片。蒜酶对压力敏感，蒜酶干粉直接压片，活力降低约5%，因此三层片先压蒜氨酸、再压隔离层，最后压蒜酶层，蒜酶活力的损失最小。由于在配方中蒜酶是催化剂，部分活力降低不影响有效成分大蒜辣素的释放。多层片包衣，避免包衣材料用有机溶剂溶解后喷雾包衣，以免蒜酶遇有机溶剂变性失活，或热风温度过高使蒜酶失活。应采用低温干法包衣。口服"蒜氨酸/蒜酶肠溶多层片"或使用"阴道蒜氨酸/蒜酶多层给药片"都需要低温保存。在包装条件下，5'C土2'C可保存两年。大蒜辣素化学性质不稳定，常温下空气中数小时即分解变质，需要-2(TC保存。本发明以蒜氨酸及蒜酶作为前体药物的二元释药系统口服"蒜氨酸/蒜酶肠溶多层片"和阴道给药"蒜氨酸/蒜酶多层片"等制剂。药片进入消化道或阴道，在体液的作用下，蒜酶与蒜氨酸相遇，蒜酶催化蒜氨酸产生大蒜辣素，被机体吸收而发挥功效用于治疗幽门螺杆菌和白色假丝酵母菌(白念)等引起的感染性疾病。阴道蒜氨酸/蒜酶多层给药片用于治疗白色假丝酵母菌(白念)等引起的阴道感染性疾病，与肠溶蒜氨酸/蒜酶多层片相似，只是药物剂量加倍，与肠溶蒜氨酸/蒜酶多层片相比较，只是外包薄膜衣而非肠溶衣。权利要求1、一种蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片，具有抗幽门螺旋杆菌及白色念珠菌等感染药效，其特征在于蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片分三层组成，中间为隔离层，在隔离层一侧为蒜氨酸与辅料混合层，另一侧为蒜酶与辅料混合层，在三层结构外面包有肠溶薄膜或普通薄膜。2根据权利要求1所述一种蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片，其特征在于包有肠溶薄膜的二元释药多层片为口服用药，包有普通薄膜的二元释药多层片为阴道用药。3、根据权利要求1所述一种蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片，其特征在于药片进入人体后，体液将肠溶薄膜或普通薄膜溶解。蒜氨酸与蒜酶相遇，迅速产生酶解反应，生成大蒜辣素而发挥疗效。4、根据权利要求1所述一种蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片，其特征在于由蒜氨酸与蒜酶催化作用生成的大蒜辣素，具有抗幽门螺旋杆菌、白色念珠菌、耐甲氧西林金葡菌、不动杆菌等病菌药效。全文摘要本发明公开了一种具有抗幽门螺旋杆菌及白色念珠菌等感染药效的蒜氨酸/蒜酶二元释药多层片。该制剂由三层组成，中间为隔离层，在隔离层一侧为蒜氨酸与辅料混合层，另一侧为蒜酶与辅料混合层，在三层结构外面包有肠溶薄膜衣(口服用)或普通薄膜衣(阴道用)。其剂型包括肠溶多层片剂及阴道多层片剂。可有效杀灭幽门螺旋杆菌、白色念珠菌、耐甲氧西林金葡菌、不动杆菌等浅表及深部霉菌感染引起的多种疾病。药物的催化剂和被催化剂受隔离剂阻挡不能反应，药物进入体内后，外层肠溶薄膜衣或普通薄膜衣被体液溶化，蒜氨酸与蒜酶相遇并开始酶解反应，4-15分钟完成反应并充分发挥疗效。文档编号A61K38/51GK101549151SQ200910009029公开日2009年10月7日申请日期2009年2月13日优先权日2009年2月13日发明者郑启武,坚陈申请人:新疆埃乐欣药业有限公司