专利名称：一种腺相关病毒载体及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种腺相关病毒载体。具体地说，涉及一种包含质粒pSub201的末端反转重复序列和质粒pRc/CMV的CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因的腺相关病毒载体。本发明还涉及用DNA重组技术制备腺相关病毒载体的方法和所述载体在介导基因转移和建立体外细胞模型中的用途。
人类基因组核苷酸草图绘制的完成，标志着以功能研究为主的后基因组时代的到来。研究基因的功能通常需要建立相应的细胞模型，以便将基因转移到正常细胞内，以观察细胞功能的变化；或者将基因转移到缺陷型或带有异常拷贝的细胞内，以恢复细胞的正常功能。
B淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，研究基因在B细胞中的生物学功能对免疫学研究和临床治疗具有重要意义。B细胞在体外不能被长期培养，而EB病毒(Epstein-Barr Virus，简称EBV)转化的B细胞(B-LCL)可以在体外长期生存(Miller G.,Epstein-Barr virus.In field BN,Knipe DM,ChanockRM et al.,ed.Virology,Vol Ⅱ,2ndedition,New York:Raven Press,1990,1921-1958)，因而是研究特定基因在B细胞中功能的良好模型。然而，进行此类研究的前提是获得合适的转移系统，使目的基因能够高效转入宿主细胞并能够稳定表达。
目前的基因转移系统主要分为非病毒类和病毒类。非病毒类转移系统，如裸DNA和质粒DNA介导的基因转移效率很低，外源基因只能在宿主细胞瞬时表达(Levy M.Y.,et al.,Characterization of plasmid DNA transfer into mouseskeletal muscle: evaluation of uptake mechanism, expression andsecretion of gene products into blood.Gene.Ther.,1996,3:201-211)。病毒类转移系统主要包括逆转录病毒、腺病毒等。逆转录病毒系统能够实现基因的高效转移和整合，但不能转导入非分裂细胞，且具有致病性(Jolly D.,Viral vector systems for gene therapy.Cancer Gen.Ther.,1994,1:55-64)。腺病毒系统能够介导分裂和非分裂细胞的基因的高效转移，但不能将其整合入宿主细胞基因组，只能实现基因的瞬时转导和表达；而且宿主对腺病毒的免疫反应亦使该系统的安全性和有效性受到质疑(Peng L.,et al.Construction of recombinant adeno-associated virus vector containingthe rat preproinsulinⅡgene.J.Surgical Res.,1997,69:193-198)。
就B-LCL的基因转移而言，逆转录病毒系统和腺病毒系统不适用于B-LCL,因为B-LCL对其介导的基因转移具有抵抗性(Hanazono Y.,et al.In vivomarking of rhesus monkey lymphocytes by adeno-associated viral vectors:Direct compari son with retroviral vectors.Blood,1999,94:2263-2270)。某些转移系统能使转入的外源基因在B-LCL中短期表达。例如，根据oriP(EBV的顺式作用元件)允许质粒在感染EBV的细胞中持续存在的特点，人们构建了带有oriP的质粒并将其用于体外基因治疗(Saeki Y.,et al.Sustained transgene expression in vitro and in viro using Epstein-Barrvirus replicon vector system combined with liposomes.Gene.Ther.,1998,5:1031-7)，尽管转导后基因的表达期限可能足以杀伤靶细胞(如肿瘤细胞)，但远不足以进行基因功能的研究。根据EBV对B细胞的亲合性，人们构建了对辅助病毒有依赖性、能复制及包装的非转化性微小EBV载体，用于将基因转入淋巴母细胞。然而EBV的DNA也不能整合入宿主染色体，经这类载体转入的基因仍然不能持续表达。Suzuki等人报导用复制缺陷型疱疹病毒-1作载体，转导的LacZ基因在EB病毒转化的B细胞SWEIG中仅表达1周(Suzuki T.,et al.Efficient gene delivery into Epstein-Barr virus(EBV)-transformedhuman B cells mediated by replication-defective herps simplex virus-1(HSV-1):a gene therapy model for EBV-related B cell malignancy.Biochem.Biophys.Res.Commun.1998,253:686-90)。综上所述，现有的转移系统都不能使转移的基因在B-LCL中长期稳定表达，因此无法满足研究基因功能的需要。
本发明的一个目的是提供一种腺相关病毒载体，所述载体为7146bp的闭环质粒，其包含质粒pRc/CMV的CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因和质粒pSub201的末端反转重复序列。
本发明的再一个目的是提供用DNA体外重组技术制备腺相关病毒载体的方法。
本发明的又一个目的是提供腺相关病毒载体在介导目的基因转入真核动物细胞中的用途，尤其是转入B-LCL中的用途。经本发明的腺相关病毒载体转入的基因可以在宿主细胞(包括B-LCL)中长期表达。
本发明的又一个目的是提供腺相关病毒载体在建立体外细胞模型中的用途。
本发明的构思如下发明人基于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)不仅能够转导入分裂和非分裂细胞，并且能够定点整合入宿主染色体组，而且没有致病性的特点，用DNA体外重组技术改造现有的AAV病毒质粒，构建一种能够使基因高效转移并在真核细胞中稳定表达的新型载体。
根据本发明的一个方面，本发明提供了一种腺相关病毒载体。所述载体为7146bp的闭环质粒，其包含质粒pRc/CMV的CMV启动子(PCMV)、多克隆位点(MCS)、新霉素抗性基因(Neor)和质粒pSub201的末端反转重复序列(ITR)。
本发明的腺相关病毒载体是以HindⅢ和XbaⅠ酶切质粒pSub201后，含有ITR的部分作为骨架(pEMBL)，以NruⅠ和SalⅠ酶切质粒pRc/CMV9后，含有PCMV、MCS及Neor的片段作为插入元件，通过DNA体外重组技术获得的。根据PCMV-MCS-Neor插入方向的不同，本发明的腺相关病毒载体pAGX有两类。PCMV-MCS-Neor正向插入的腺相关病毒载体是pAGX(+)，用ClaⅠ和SpeⅠ酶切后，产生5273bp、1207bp和666bp的片段；PCMV-MCS-Neor反向插入的腺相关病毒载体是pAGX(-)，用ClaⅠ和SpeⅠ酶切后，产生3479bp、3001bp和666bp的片段。
本发明的腺相关病毒载体具有5’-反向末端重复序列、CMV启动子、T7启动子、多克隆位点、Sp6启动子、BGH加尾信号、M13复制原点、SV40早期启动子、新霉素抗性基因、SV40加尾信号、3’-反转末端重复序列等遗传元件。
本发明的腺相关病毒载体上有多个限制性内切酶切位点，pAGX(+)上的部分酶切位点及其起始位点列举如下ApaⅠ(979),BamHⅠ(897,1272,3241),BstⅪ(913,943),BglⅠ(322,444,515,2008,4632,7086),ClaⅠ(6176),EcoRⅠ(928,1732),HindⅢ(879),MscⅠ(121,2353,3327),NotⅠ(954),PstⅠ(933,2320),PvuⅡ(1254,2375,3448,7146),SalⅠ(3248),SmaⅠ(68,79,2082,3369,3380),SpeⅠ(237,903),XbaⅠ(973)。其中适用于克隆的酶切位点包括HindⅢ、BstⅪ、NotⅠ、XbaⅠ和ApaⅠ。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了腺相关病毒载体的制备方法。方法包括A．用HindⅢ和XbaⅠ酶切质粒pSub201，回收含有末端反转重复序列的片段；B．用NruⅠ和SalⅠ酶切质粒pRc/CMV，回收含有CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因的片段；C．用Klenow酶补平回收的片段，用DNA连接酶进行连接；D．重组载体转化大肠杆菌后筛选阳性克隆。
腺相关病毒质粒pSub201含有AAV反向末端重复序列(inverted terminalrepeat,ITR)，复制基因(rep)与包装基因(cap)基因，其中ITR基因是腺相关病毒包装、整合和复制必须的，它还可以调节基因的转录。质粒pRc/CMV9含有在真核动物细胞中表达所需要的CMV启动子(PCMW)，可作为筛选标志的新霉素抗性基因，可用于外源基因插入的多克隆位点。
HndⅢ和XbaⅠ酶切pSub201后，回收3448bp含ITR的片段作为本发明腺相关病毒载体的骨架pEMBL。NruⅠ和SalⅠ酶切真核表达质粒pRc/CMV9，回收3698bp含有CMV启动子(PCMV)、多克隆位点及新霉素抗性基因(Neor)的片段作为重组载体的插入元件。为了提高实验的效率，用于连接的回收片段优选纯化过的。可以用本领域已知的任何方法纯化回收的片段，一种较简便的方法是用凝胶纯化并回收所需片段。带有不匹配粘末端的酶切片段需要用Klenow酶补平，再用牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去除线性DNA上的5’磷酸基团。在DNA连接酶的作用下，pSub201的骨架与pRc/CMV中含PCMV、MCS及Neor的片段连接，产生重组的腺相关病毒载体pAGX。经转化大肠杆菌DH5α后，藉对氨苄青霉素和新霉素的抗性筛选阳性克隆。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了腺相关病毒载体在介导目的基因转移到真核细胞中的用途。具体的使用方法包括A．将目的基因插入腺相关病毒载体的多克隆位点；B．在宿主细胞内包装并拯救带有目的基因的重组腺相关病毒载体；C．用包装后的重组腺相关病毒载体转导真核动物细胞。
外源基因片段(如正义的cDNA片段或反义的cDNA片段)插入腺相关病毒载体pAGX的多克隆位点后，需要经过包装和拯救才能成为有感染毒力的颗粒。这是因为pAGX没有病毒复制基因(rep)与包装基因(cap)，它需要借助辅助质粒或辅助噬菌体的rep与cap，方能整合入宿主细胞基因组。同时，腺相关病毒载体是一种有缺陷的病毒载体，整合入宿主细胞基因组的DNA通常情况下只发生潜伏性感染，其rep基因的转录处于抑制状态。只有在宿主细胞同时感染腺病毒的情况下，腺病毒基因编码的某些蛋白可以解除rep的转录抑制状态，启动DNA的复制，整合入宿主细胞染色体的pAGX DNA才能被拯救。即pAGX的正链和负链能够被单独包装成具有毒力的粒子，产生子代病毒载体。能够被包装后的重组腺相关病毒载体感染的真核细胞优选哺乳动物细胞，更优选EB病毒转化的B细胞。
在本发明的优选实施例中，pAGX(+)的包装是采用磷酸钙沉淀共转染法，通过用辅助质粒pAAV/Ad和pAGX(+)共同转染293细胞实现的。拯救是通过在转染过程中加入野生型腺病毒Ad5完成的。
为鉴定pAGX转移外源基因的能力和效率，本发明的一个实施例以黄色荧光素蛋白(EYFP)作为报告基因进行检测。携带EYFP基因的重组腺相关病毒载体pAEYFP经包装后，pAEYFP储存液的感染滴度达1.39×107t.u./ml，复制滴度达1.94×1011颗粒/ml。Southern杂交表明EYFP基因获得成功拯救。pAEYFP颗粒转导哺乳动物细胞COS 7后，EYFP基因整合入COS 7细胞的基因组，并能够长期稳定表达。pAEYFP转导EB病毒转化的B细胞SKW6和3D5细胞后，EYFP亦获得稳定表达。这说明pAGX作为基因转移载体的有效性和实用性。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了腺相关病毒载体在建立体外细胞模型中的用途。在本发明的一个实施例中，用pAGX(+)分别将6A8α-甘露糖苷酶基因的正义cDNA片段和反义cDNA片段转入EB病毒转化的B细胞株(B-LCL)SKW6和3D5。细胞培养24个月之后，α-甘露糖苷酶活性检测和RT-PCR检测均显示6A8反义cDNA片段的转入使细胞内的6A8α-甘露糖苷酶表达持续抑制，Con-A结合实验显示细胞内蛋白质的糖基化受到干扰。因此，发明人通过使用腺相关病毒载体，建立起可以研究6A8α-甘露糖苷酶对B-LCL功能影响的细胞模型。通过这种细胞模型，发明人发现6A8α-甘露糖苷酶的表达抑制使SKW6细胞对Fas抗体诱导的凋亡发生抵抗。在本发明的另一个实施例中，发明人通过腺相关病毒载体pAGX(+)，建立起人淋巴细胞膜相关抗原5D4反义cDNA片段转入的B-LCL细胞模型，用以研究反义5D4 cDNA片段的转入对细胞的影响。因此，利用本发明的腺相关病毒载体可以建立起多种细胞模型，用以研究基因的长期表达或抑制对细胞功能的影响。细胞模型优选在哺乳动物细胞中建立，更优选在EB病毒转化的B细胞中建立。此外，由于许多B细胞的恶化与EB病毒感染有关，本发明的腺相关病毒载体还可以在基因治疗(例如治疗恶化的B细胞)等方面发挥作用。
为了更清楚地理解本发明，对本发明使用的部分术语和操作方法作如下说明。
“基因”是指与产生多肽有关的DNA片段，包括编码区(外显子)之前和之后的区域，以及在各个编码区之间的间插序列(内含子)。
“质粒”以小写字母p和后续的大写字母或数字命名。本文的起始质粒是公众可以通过市售途径无限制获得的，或者是可以按照已经公开的制备的方法获得的。
“酶切”或“消化”是指用限制性核酸内切酶催化切割DNA的反应。正如本领域的普通技术人员所知的，特定的限制性内切酶仅识别并作用于特定的DNA序列，酶切的反应条件、辅助因子及其它要求应当视具体的酶而定。本发明使用的限制性核酸内切酶都是市售的。对于市售的酶而言，可以参照生产商推荐的条件，选择合适的缓冲液和加入底物的量。为了分析的目的，一般可以在约20微升缓冲液中使用1-2个单位的酶消化1微克质粒或DNA片段，37℃作用1-2小时的反应条件可以满足大多数酶切反应的要求。酶切后的产物可以直接在聚丙烯酰胺凝胶或琼脂糖凝胶上电泳，以达到分离的目的。
“连接”指在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。
“pEMBL骨架”是指pSub201经HindⅢ和XbaⅠ酶切后，构建重组腺相关病毒载体pAGX所需要的含有末端反转重复序列的片段。
“包装”是指病毒的核酸复制后，cap基因编码的包装蛋白与病毒的核酸组装在一起，形成完整病毒颗粒的过程。
“拯救”是指将整合到宿主染色体组上、处于隐性感染状态(不复制，不包装)的腺相关病毒载体激活的过程。即在某些基因的活动下，腺相关病毒载体复制并包装成病毒颗粒的过程。
“复制滴度”是指有毒力的病毒感染细胞后，一定数量的细胞裂解物中含有的病毒颗粒。复制滴度的单位是“病毒颗粒数/ml”，病毒颗粒数越多，复制滴度越高。
“感染滴度”是指一定数量的病毒能够感染的细胞数。感染滴度的单位为转导单位(transducing unit,t.u)，在本发明中,3×106t.u./ml表示1ml的病毒储存液能够感染3×106个细胞。
“感染效率”是指以合适感染复数(MOI)的病毒感染细胞，被感染的细胞占被检测的全部细胞的比例。
除另有说明的外，本发明的实验操作均参照《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，1996，科学出版社出版)进行。
为了更清楚地理解本发明的实质，现参照附图和实施例对其进行解释。附图和实施例是为了说明而不以任何方式限制本发明。
图1显示了腺相关病毒载体的构建过程。
图2显示了重组腺相关病毒的包装程序。
图3反映了用基因组PCR法检测新霉素抗性基因在宿主细胞染色体组整合的情况。图3A是在SKW6细胞的检测结果，图3B是在3D5细胞的检测结果。
图4反映了用RT-PCR法分析转导的6A8 cDNA片段在细胞内的转录情况。
图5是6A8 cDNA片段转导后，Con A结合实验的结果。
图6显示了Fas抗体诱导SKW6细胞凋亡的梯形DNA检测结果。
实施例一、pAGX(+)和pAGX(-)的构建腺相关病毒质粒pSub201含有反向末端重复序列(inverted terminalrepeat，简称ITR)，复制基因(rep)与包装基因(cap)基因(Samulski R.J.,etal.,Recombinant plasmid from which an infectious adeno-associated virusgenome can be excised in vitro and its use to study viral replication,J.Virol.,1987,61:3096-3101)。真核表达质粒pRc/CMV9(Introgen公司)含有CMV启动子(PCMV)、多克隆位点(MCS)及新霉素抗性基因(Neor)。
质粒pSub201用HindⅢ和XbaⅠ酶切。质粒pRc/CMV用NruⅠ和SalⅠ酶切。凝胶回收纯化所需片段，切端均用Klenow酶补平。3448bp的pSub201骨架中含ITR和氨苄青霉素抗性基因，经牛小肠碱性磷酸酶(CIP)去磷酸化后，与pRc/CMV中含CMV启动子(PCMV)、多克隆位点(MCS)及新霉素抗性基因(Neor)的3698bp片段藉T4 DNA连接酶连接，构建重组pAGX载体。经转化大肠杆菌DH5α后，藉对氨苄青霉素和新霉素的抗性筛选阳性克隆。扩增并提取重组质粒，经SalⅠ、ClaⅠ-HindⅢ、ClaⅠ-SpeⅠ、ClaⅠ-XbaⅠ酶切确定含PCMV、MCS,Neor片段的插入方向。
结果称PCMV-MCS-Neor正向插入的重组AAV载体为pAGX(+)，称相反方向者为pAGX(-)。
pAGX(+)全长7146bp，框架区3448bp。多克隆位点内可用于克隆的限制性内切酶位点为HindⅢ,BstXⅪ,NotⅠ,XbaⅠ和ApaⅠ。pAGX(+)构建过程见图1，pAGX(+)上的部分元件见表1。
表1腺相关病毒载体pAGX(+)的部分元件pAGX(+)的部分元件起始位点终止位点5’-反向末端重复序列 1194CMV启动子198 852T7启动子 853 876多克隆位点 879 979Sp6启动子981 1007BGH加尾信号 1009M13复制原点 1273SV40早期启动子 1732新霉素抗性基因 2108SV40加尾信号 29663’-反转末端重复序列 3254 3448pEMBL骨架3449 7146实施例二、pAGX(+)转导黄色荧光素蛋白基因1．pAEYFP和pEYFPCMV的构建为构建包含黄色荧光素蛋白(EYFP)的重组载体pAGX(+)，用HindⅢ和NotⅠ酶切pEYFP-1(Clontech公司)，将EYFP片段插入pAGX(+)的HindⅢ和NotⅠ位点。用HindⅢ-NotⅠ酶切鉴定EYFP片段插入情况，用PstⅠ酶切鉴定插入方向。
构建报告质粒pEYFPCMV作为对照。用SalⅠ和BamHⅠ酶切质粒pRc/CMV，回收CMV启动子片段，插入经SalⅠ和BamHⅠ酶切的pEYFP-1质粒，构建重组质粒pEYFPCMV。
结果用HindⅢ-NotⅠ酶切鉴定EYFP基因插入情况，出现779bp EYFP片段的克隆为阳性克隆。用PsfⅠ酶切鉴定插入方向，将酶切后出现249bp、1880bp和5721bp的质粒作为EYFP基因正向插入的质粒，将其命名为pAEYFP。
质粒pEYFP-1重组质粒pEYFPCMV经SalⅠ-BamHⅠ酶切获得877bp的CMV启动子序列片段，用PstⅠ酶切获得1131bp和3925bp片段，用PstⅠ-SpeⅠ酶切获得223bp、887bp和3946bp片段。上述结果证明pEYFPCMV构建正确。由于pEYFPCMV是一个普通的重组质粒，不能被包装成病毒，因此可以作为pAEYFP包装的阴性对照。2．pAEYFP的包装和拯救磷酸钙共沉淀法转染试剂盒购自GIBCO/BRL公司，辅助质粒pAAV/Ad(Samulski R.J.,et al.,Helper-free stocks of recombinant adeno-associated viruses normal integration does not require viral geneexpression,J.Virol.,1989,63:3822-3828)和野生型腺病毒Ad5为本室保存。293细胞(ATCC CRL 1537)是用截断的腺病毒Ad5 DNA转化的人胚胎肾细胞株。
当293细胞生长到60-80％汇片时，换液为10ml含10％NBS但无抗生素的新鲜DMEM液。3小时后，加入1ml pAEYFP与pAAV/Ad(各12.5μg)的磷酸钙共沉淀混合液。以质粒pEYFPCMV作为包装的阴性对照组，进行同步实验。12小时后，用新鲜的DMEM完全液置换原有的培养液，同时加入野生型腺病毒Ad5(感染复数MOI:2)以拯救pAEYFP。48-72小时后，轻轻刮下细胞，悬细胞于1mlTBS(50mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L NaCl)中，经反复冻融四次后，除去细胞碎片。上清部分于56℃30分钟以灭活腺病毒Ad5，此即为pAEYFP储存液，于-20℃保存备用。3．pAEYFP中EYFP基因的拯救情况鉴定参照Hirt等人的方法(Hirt B.,Selective extraction of polyoma DNAfrom infected mouse cell culture.J.Mol.Biol.,1967,26:365-9)从pAEYFP储存液中分离出低分子量DNA。简言之，取100μl pAEYFP储存液，加入以下试剂并使其终浓度为Tris-HCl(pH8.0)20mmol/L,EDTA(pH8.0)20mmol/L,SDS0.5％，蛋白酶K50μg/ml。37℃温浴1小时后，加入1/5体积5mol/L NaCl。冰浴1小时后，12,000rpm离心30分钟，上清经抽提后，用等体积的异丙醇沉淀低分子量DNA。TE(pH8.0)溶解DNA。用DpnⅠ和HindⅢ-NotⅠ完全酶切后，Southern转移此DNA于带正电荷的尼龙膜上。以[α-32P]-dCTP标记的EYFP DNA作探针。
结果从尼龙膜上DNA中探测到单聚体和二聚体两种形式的EYFP基因，表明EYFP基因获得成功拯救。4．pAEYFP感染滴度和复制滴度的测定用不同稀释度pAEYFP与腺病毒Ad5(MOI:1)共感染293细胞24小时后，计数黄色荧光细胞以计算pAEYFP的感染滴度。
从25μl pAEYFP储存液或500μl上清中分离所得的低分子量DNA经DpnⅠ酶切，以两倍梯度连续稀释，藉Slot Blot装置(BioRad公司)将此DNA负载于带正电荷的尼龙膜上。以两倍连续稀释的pAEYFP作定量标准品，标准品浓度梯度为100ng、50ng、25ng和12.5ng。用[α-32P]-dCTP标记的EYFP DNA作探针杂交，对照标准品杂交反应的强度，计算两次包装中pAEYFP的复制滴度。
结果见表2。
表2 pAEYFP的感染滴度和复制滴度感染滴度(t.u./ml)复制滴度(颗粒/ml)第一次包装3.06×1065.5×1010第一次包装2.47×1073.32×1011平均值1.39×1071.94×10115．PAEYFP转导哺乳动物细胞-COS 7细胞(1)．Southern杂交探测EYFP基因的整合当COS 7细胞于6孔细胞培养板中生长至约50-80％汇片时，用100μlpAEYFP储存液转导COS 7细胞。同时，以pEYFPCMV储存液作阴性对照组，脂质体法转染pEYFPCMV(转染试剂盒购自GIBCO/BRL公司)的细胞作阳性对照组。48-72小时后，1∶6-1∶10稀释细胞培养，并加入G418(新霉素类抗生素)400μg/ml，筛选至阴性对照组细胞全部死亡后1周，生存细胞即为转导和转染成功的细胞。
当细胞在50cm2细胞培养瓶中生长至90-100％汇片时，裂解细胞，按常规提取基因组DNA。用PstⅠ完全酶切基因组DNA后，按Southern法转移至带正电荷的尼龙膜上，以[α-32P]-dCTP标记的EYFP/HindⅢ-NotⅠ片段DNA作杂交探针，以野生型、转导空载rAAV和脂质体法转染pEYFPCMV的细胞作对照。
结果Southern杂交表明EYFP基因经pAEYFP转导整合入了COS 7细胞基因组，而经质粒pEYFPCMV介导的EYFP基因转移未能整合入COS-7细胞基因组。(2)．EYFP在COS 7细胞的表达分别在转导或转染后48小时以及G418筛选后，用激光共聚焦显微镜(Meridian公司，型号Ultima212)观察COS 7细胞黄色荧光发光情况，以判断EYFP基因在COS 7细胞的表达。
结果在转导EYFP基因48小时后，部分COS 7细胞呈现黄色荧光，表明EYFP基因成功转导并获得表达。经G418筛选后，COS 7细胞均呈黄色荧光，阳性率为100％。用作阳性对照的、经脂质体转染的pEYFPCMV中的EYFP基因在COS 7细胞也获得表达。6．pAEYFP感染B细胞的频率
SKW6(ATCC TIB 215)和3D5细胞(参见朱立平等，一个对B细胞生长因子(BCGF)有特异反应的人B细胞株(3D5)的建立，中华微生物学和免疫学杂志，1989,9:284)是EB病毒转化的B细胞。包装后的pAEYFP分别感染SKW6细胞和3D5细胞1小时，继续培养48小时。以野生型细胞作为阴性对照，用流式细胞仪(Coulter公司，型号ETICS ELITE ESP)检查表达黄荧光的细胞。
结果SKW6细胞的感染率为64±3.5％(个细胞)，3D5细胞的感染率为58±6.2(个细胞)。实施例三、pAGX(+)转导6A8-甘露糖苷酶基因1．含正义6A8 DNA片段和反义6A8 DNA片段的pAGX(+)的构建含6A8 cDNA 3’端1 358 bp的正义6A8 DNA或反义6A8 DNA片段的重组质粒pRc/CMV的构建过程参见Li B.,et al.Cloning,expression andcharacterization of a cDNA(6A8)encoding a new human α-mannosidase.Europ.J.Biochem.2000,276:7176-7182。用限制性内切酶HindⅢ/XbaⅠ分别从含正义6A8 DNA和反义6A8 DNA的重组质粒pRc/CMV中酶切，并行胶回收含1358bp的正义和反义6A8 DNA片段，插入pAGX(+)载体的HindⅢ-XbaⅠ位点。获得的含正义6A8 DNA或反义6A8 DNA的重组AAV载体pAGX(+)，分别命名为pAGX(+)-正义6A8 DNA及pAGX(+)-反义6A8 DNA。用EcoRⅠ和HindⅢ/XbaⅠ酶切鉴定正义或反义6A8 DNA片段是否插入。用PstⅠ和ApaⅠ酶切鉴定6A8 DNA片段在AAV载体pAGX(+)中的插入方向。
结果用EcoRⅠ酶切后，pAGX(+)-正义6A8 DNA和pAGX(+)-反义6A8 DNA均产生804bp、1358bp和6284bp的片段；用HindⅢ/XbaⅠ酶切后，二者均产生1394bp和7052bp的片段。该结果说明目的片段后插入了重组载体，因为未插入目的基因的pAGX(+)经EcoRⅠ酶切应产生804bp和6342bp的片段，经HindⅢ/XbaⅠ酶切则应产生94bp和7052bp的片段。
将PstⅠ酶切后产生595bp、756bp、1347bp和5748bp的重组载体作为pAGX(+)-正义6A8 DNA,ApaⅠ酶切后其产生616bp、733bp和7097bp的片段；将PstⅠ酶切后产生130bp、595bp、1347bp和6374bp的重组载体作为pAGX(+)-反义6A8 DNA,ApaⅠ酶切后，其产生89bp、616bp和7741bp的片段。2．pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA的包装和拯救12.5μg的pAGX(+)、pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA分别与12.5μg的辅助质粒pAAV/Ad用磷酸钙共沉淀法共转染293细胞，并在野生型腺病毒Ad5辅助下拯救重组载体(rAAV)，以pRc/CMV-正义6A8 DNA替代rAAV作包装的阴性对照组。分别从293细胞沉淀中得到空载、含正义6A8DNA、含反义6A8 DNA的rAAV颗粒(rAAV储存液)，于-20℃储存备用。分别从100μl rAAV储存液和2ml细胞培养上清中分离到低分子量DNA，用限制性内切酶DpnⅠ和EcoRⅠ完全酶切后，进行Southern杂交，用[α-32P]-dCTP标记的6A8 DNA作探针。
结果从pAGX(+)-正义6A8 DNA和pAGX(+)-反义6A8 DNA储存液中探测到单体和双体两种形式的DNA杂交带。而阴性对照组的细胞裂解液中未见杂交带。上述结果证明pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA拯救成功。3．pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA复制滴度的测定从25μl rAAV储存液和1ml细胞培养上清中分离得到的DNA，经限制性内切酶DpnⅠ完全酶切后，以两倍梯度连续稀释行狭缝点膜，并用50ng、25ng、12.5ng和6.25ng的pAGX(+)-正义6A8 DNA作标准品，用[α-32P]-dCTP标记的6A8 DNA探针杂交，对照标准品的杂交强度计算rAAV的复制滴度。
结果狭缝杂交(图片未显示)从阴性对照组(pRc/CMV-正义6A8 DNA包装组)细胞沉淀裂解液中未探测到6A8 DNA杂交信号，说明其中不存在rAAV颗粒。从pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA细胞沉淀的裂解液中可探测到6A8 DNA杂交信号。而从正义和反义6A8 DNA包装组培养上清中分离的DNA经DpnⅠ酶切后，杂交信号很弱，表明重组AAV未释放。对照标准品计算复制滴度的结果见表3。
表3 pAGX(+)-正义6A8 DNA和pAGX(+)-反义6A8 DNA的复制滴度实验分组复制滴度(×1011病毒颗粒/ml)实验1实验2平均值阴性对照组---pAGX(+)空载体 ---pAGX(+)-正义6A8 DNA2.04 3.86 2.95pAGX(+)-反义6A8 DNA4.8010.02 7.414．pAGX(+)-正义6A8 DNA、pAGX(+)-反义6A8 DNA转导淋巴细胞SKW 6细胞、3D5细胞是EB病毒转化的B细胞，BJAB是Burkitt淋巴瘤细胞株，其表面标志为CD19+CD3-CD4-CD8-。
用100μl rAAV储存液重悬1×106的细胞(MOI约10)，并用等体积包装阴性对照组的细胞裂解液作对照。于37℃作用1小时，再加入含10％的FCS和抗生素的RPMI 1640完全培养液，24小时后，更换为新鲜的RPMI 1640完全培养液，继续培养24至48小时，然后加入G418进行筛选，G418终浓度分别为SKW 6和3D5细胞600μg/ml,BJAB细胞800μg/ml。筛选至阴性对照组细胞全部死亡后7至10天为止，存活细胞即为转导成功的细胞。采用有限稀释法进行转导细胞的克隆。即将细胞稀释为5个/ml，于96孔细胞培养板中每孔加入200μl稀释的细胞悬液进行克隆，视细胞生长情况更换部分完全培养液。5．Northern杂交检测转导的正义和反义6A8 DNA片段的表达收获生长良好的细胞(5×106细胞/ml)，按照TRIZOL试剂盒(GIBCO公司)说明书提取细胞总RNA，并行电泳检查RNA质量。按常规转移RNA于尼龙膜上，用[α-32P]-dCTP标记的6A8 DNA探针探测6A8 DNA的表达。并以[α-32P]-dCTP标记的β-actin DNA为探针杂交作对照。
结果在转导了正义和反义6A8 DNA的SKW6细胞、3D5细胞克隆株中检测到长度约1.5kb的转导基因的转录本，但在不同的克隆株中表达水平不同。BJAB细胞在转导了反义6A8 DNA后于克隆中死亡，但从转导了正义6A8 DNA的BJAB细胞和未经克隆的、转导了反义6A8 DNA的BJAB细胞中亦检测到到长约1.5kb的转导基因的转录本。6．基因组PCR检测新霉素抗性基因(neoR)在宿主细胞的整合按照《分子克隆实验指南(第二版)》(J.萨姆布鲁克等著，金冬雁等译，1996，科学出版社出版)描述的方法从细胞内提取基因组DNA作为PCR反应的模板。
neoR的上游引物为5’TTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGG 3’；neoR的下游引物为5’AAAGCGGCCATTTTCCACCAT 3’。
反应条件为94℃预变性5分钟；94℃,45秒→58℃,45秒→72℃90秒，30个循环；循环结束后72℃延伸5分钟。
结果如图3所示，在转导了空载、正义、或反义6A8 DNA的细胞中都检测到明显的neoRmRNA表达，而在野生型细胞则未见neoRmRNA表达。7．RT-PCR检测转导的6A8 cDNA片段在细胞内的转录以5×105细胞(已传代培养24个月)来源的细胞总RNA作模板，用无RNA酶H的SuperScriptTMⅡ逆转录酶逆转录合成cDNA第一链，然后加RNA酶H去除RNA。在50μl反应体系中，分别用1μl经不同稀释度稀释的逆转录产物作模板，行PCR反应。为检测6A8 cDNA 3’端mRNA(1358bp)的表达，以甘油醛3磷酸脱氢酶(GAPDH)mRNA的表达作为内参照。
6A8 3’端上游引物5’CCCTGGAAGCGGATCGAAGTGATG 3’；6A8 3’端下游引物5’GGTCGCTCCAAGAGAGATCGCAGAGG 3’。
GAPDH cDNA的上游引物为5’CCATGGAG从GGCTGGG 3’；GAPDH cDNA的下游引物为5’C从AGTTGTCATGGATGACC 3’。
反应条件为94℃预变性5分钟；94℃,45秒→58℃,60℃,45秒→72℃90秒，30个循环；循环结束后72℃延伸5分钟。
结果如图4所示，转导正义6A8 DNA的4个克隆株和转导反义6A8 DNA的5个克隆株中6A8基因的表达量明显增加。8．正义和反义6A8 cDNA片段的转导对EB病毒转化的细胞中6A8α-甘露糖苷酶的影响(1)．6A8α-甘露糖苷酶活性的检测细胞研磨成匀浆，用α-甘露糖苷酶底物对-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙(pnitro-phenyl-α-D-mannopyranoside)测定细胞匀浆上清中的酶活性。α-甘露糖苷酶降解对-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙后产生对-硝基酚，测定细胞匀浆在410nm的光吸收。设野生型细胞匀浆上清中α-甘露糖苷酶的活性为1。
结果见表4，转导了反义6A8 cDNA片段的B-LCL中，6A8α-甘露糖苷酶的活性明显降低。表4 B-LCL细胞中6A8α-甘露糖苷酶的活性测定底物(对-硝基-苯-α-D-甘露糖吡喃甙)细胞 SKW6胞 3D5胞野生型 1.0 1.0转导空载体1.0±0.08 1.10±0.07转导rAAV-正义6A8 cDNA片段 1.14±0.2 0.92±0.14转导rAAV-正义6A8 cDNA片段 0.56±0.17 0.67±0.21(2)．Con A结合试验-6A8α-甘露糖苷酶基因表达的检测细胞(已传代培养24个月)经PBS洗涤三次后，铺于载玻片上，晾干，用4％多聚甲醛于室温固定15mim,PBS冲洗三遍，晾干，加0.1％Triton X-100/0.1％枸橼酸钠溶液于4℃作用2mim，用PBS淋洗三遍后晾干。滴加用0.5％BSA-PBS溶液稀释的终浓度为20μg/ml的FITC-Con A(异硫氰酸荧光素标记的刀豆蛋白A,Sigma公司)20μl，于37℃温育30mim,PBS淋洗三遍后，用50％甘油封片，用激光共聚焦显微镜观察荧光染色强度。
结果如图5所示，转导空载pAGX(+)的SKW 6和3D5细胞的FITC-Con A染色强度与野生型细胞无明显差异；转导pAGX(+)-正义6A8 DNA的SKW 6和BJAB细胞的FITC-Con A染色强度的变化不大；转导pAGX(+)-反义6A8 DNA的SKW 6和BJAB细胞的FITC-Con A染色强度明显升高。
由于α-甘露糖苷酶的作用是修剪糖蛋白中的甘露糖，而糖蛋白中高甘露糖型聚糖上的甘露糖是Con A的受体。Con A结合实验可以检测正义和反义6A8DNA的转导对6A8α-甘露糖苷酶基因的影响。实验结果说明反义6A8 DNA的转录产物能与6A8α-甘露糖苷酶mRNA互补形成双链，因而阻断6A8基因的翻译，并引起糖蛋白上甘露糖修剪减少，导致Con A结合升高。7．pAGX(+)-反义6A8 DNA片段对细胞凋亡的影响(1)．Giemsa染色细胞用PBS洗涤3次后铺于载玻片上，晾干，用醋酸-甲醇(1∶3)固定30分钟，PBS淋洗3次,晾干后用1∶10稀释的Giemsa染液于室温染色20min,PBS淋洗3次，然后用树脂封片，于光学显微镜下观察。(2)．Annexin-V荧光染色取20μL Annexin-V试剂(德国罗氏公司)和20μL碘化丙啶(PI)储存液，用1ml Hepes缓冲液稀释，制成为染色工作液。1×106个细胞经PBS离心洗涤一次后，用100μL染色工作液重悬，于室温染色15min，然后用流式细胞仪分析细胞染色情况。(3)．梯形DNA的提取和电泳取1×106的细胞，用TBS(pH7.4)洗涤2次后，用400μL裂解缓冲液(10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、10mmol/L NaCl、10mmol/L EDTA(pH8.0)、0.5％SDS、50μg/ml蛋白酶K)裂解细胞，于37℃温浴2小时。样品于室温14000转/分离心10分钟，弃沉淀，上清用酚-氯仿(1∶1)-酚-氯仿-异丙醇(25∶24∶1)-氯仿抽提。上清中加入1/5体积的3mol/L醋酸钠(pH5.2)和两倍体积的无水乙醇，混匀后置-20℃过夜。于-4℃12,000转/分离心15分钟，弃上清，用70％乙醇洗涤沉淀，然后于-4℃12,000转/分离心15分钟，弃乙醇，晾干，用22μL TE(pH8.0)溶解DNA沉淀物，再加入2μl的RNA酶A，于37℃温浴1小时，加6μl加样缓冲液后，加样于2％琼脂糖凝胶上电泳，观察梯形DNA的有无。100bp梯形DNA分子量标准为鼎国生物技术公司产品。
结果Giemsa染色经抗Fas抗体诱导24小时的细胞，观察细胞形态以确定凋亡情况。转导了pAGX(+)-反义6A8 cDNA的5个克隆细胞株中的凋亡细胞数与未经抗Fas抗体诱导的细胞株无明显差异，而野生型细胞和转导了空载pAGX(+)的3个克隆细胞株凋亡细胞数明显增多。
经Annexin-V荧光染色，测得未经抗Fas抗体诱导的SKW 6野生型细胞的阳性染色阳性率为4.8％；经抗Fas抗体诱导24小时的SKW 6野生型细胞染色阳性率为72.6％。诱导后，转导了空载pAGX(+)的3个克隆细胞株之间染色阳性率无明显差异(80.1％、75％和78.4％)，相对于野生型细胞亦无明显差异；而在转导了pAGX(+)-反义6A8 cDNA的5个克隆细胞株中，有4个克隆的染色阳性率(48.9％、44.6％、52.8％和41.5％)明显降低，仅1个克隆的染色阳性率降低较少(70.3％)。
从图6可见，转导了空载rAAV的克隆细胞株(图5:2-4)产生梯形DNA的情况与野生型细胞(图5:1)基本无差异，而转导了rAAV-反义6A8 DNA的5个克隆细胞株中(图5:5-9)，除克隆7在诱导36h时出现微弱的梯形DNA外，均未出现明显梯形DNA。实施例四、pAGX(+)转导人淋巴细胞膜相关抗原5D4基因1．含反义5D4 cDNA片段的pAGX(+)的构建5D4 cDNA(马凤蓉等，编码人分化抗原5D4的全长cDNA克隆及其编码蛋白质的二级结构分析，中国科学(C辑)，1999年，29卷，第6期，615-620)是人淋巴细胞膜相关抗原(GenBank注册号AF043290)。PCR扩增得到413bp的5D4 cDNA的反义片段(包含5D4 cDNA的第88-484位核苷酸)。上游引物(5’-CGGGGCCCATGAAGCAGAACCTCCCAGAA-3’)带有ApaⅠ酶切位点，下游引物(5’-CGAAGCTTCCAGCATAAGAAGCAAACCAT-3’)带有HindⅢ酶切位点。扩增后的5D4cDNA反义片段经限制性内切酶ApaⅠ和HindⅢ酶切，插入pAGX(+)的ApaⅠ-HindⅢ位点。获得pAGX(+)-反义5D4 DNA。
同时，用BamHⅠ和SalⅠ酶切5D4 cDNA，插入pRc/CMV的BamHⅠ-SalⅠ的位点构建pRc/CMV-5D4 DNA，作为pAGX(+)-反义5D4 DNA的阴性对照。2．pAGX(+)-反义5D4 DNA的包装和拯救分别用12.5μg的pAGX(+)、pAGX(+)-反义5D4 DNA与12.5μg的辅助质粒pAAV/Ad用磷酸钙共沉淀法共转染293细胞，并在野生型腺病毒Ad5辅助下拯救rAAV，以pRc/CMV-5D4 DNA作包装的阴性对照组。分别从293细胞沉淀中得到空载、含反义5D4 DNA片段的rAAV颗粒(rAAV储存液)，于-20℃储存备用。分别从100μl rAAV储存液和2ml细胞培养上清中分离到低分子量DNA，用限制性内切酶DpnⅠ和EcoRⅠ完全酶切后，进行Southern杂交，用[α-32P]-dCTP标记的5D4 DNA作探针。结果从pAGX(+)-反义5D4 DNA储存液中探测到单体和双体两种形式的DNA杂交带，而阴性对照组的细胞裂解液中未见杂交带。该结果说明pAGX(+)-反义5D4 DNA拯救成功。3．pAGX(+)-反义5D4 DNA复制滴度的测定从25μl rAAV储存液和1ml细胞培养上清中分离得到的低分子量DNA，经限制性内切酶DpnⅠ完全酶切后，以两倍梯度连续稀释行狭缝点膜，并用50ng、25ng、12.5ng和6.25ng的pAGX(+)-5D4 DNA作标准品，用[α-32P]-dCTP标记的6A8 DNA探针杂交，对照标准品的杂交强度计算rAAV的复制滴度。结果两次包装的复制滴度分别为1.82×1011颗粒/ml和0.70×1011颗粒/ml，平均值为1.26×1011颗粒/ml。4．pAGX(+)-反义5D4 DNA转导B-LCL用100μl rAAV储存液重悬1×106的SKW 6和3D5细胞(MOI约10)，并用等体积包装阴性对照组的细胞裂解液作对照。于37℃作用1小时，再加入含10％的FCS和抗生素的RPMI 1640完全培养液，24小时后，更换为新鲜的RPMI 1640完全培养液，继续培养24至48小时，然后加入终浓度为600μg/ml的G418进行筛选。筛选至阴性对照组细胞全部死亡后7至10天为止，存活细胞即为转导成功的细胞。采用有限稀释法进行转导细胞的克隆。即将细胞稀释为5个/ml，于96孔细胞培养板中每孔加入200μl稀释的细胞悬液进行克隆，视细胞生长情况更换部分完全培养液。5．反义5D4 DNA片段的转导对B-LCL中5D4蛋白的影响从原核表达系统获得的5D4蛋白经纯化后免疫小鼠，制得5D4单克隆抗体。先用5D4单克隆抗体染色细胞(已传代培养12个月)，再用FITC标记的羊抗鼠免疫球蛋白染色细胞，用流式细胞仪检测荧光强度。以小鼠IgG1作为阴性对照。
结果相对野生型细胞而言，反义5D4 DNA片段转导后，SKW6和3D5细胞内的5D4单克隆抗体荧光染色强度明显降低。说明反义5D4 DNA片段转导后，抑制了细胞内5D4蛋白的表达。
应当指明的是，本发明并不限于上述具体的实施例，实施例仅是用于更清楚地说明本发明。事实上，根据本文的描述和有关附图，本领域的技术人员可以作出某些改变。这些改变应视作显而易见的，功能上等同的方法和物质已经包含在本发明的范围内。
权利要求
1．一种腺相关病毒载体pAGX，所述载体为7146bp的闭环质粒，其包含质粒pSub201的末端反转重复序列和质粒pRc/CMV的CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因。
2．权利要求1所述的腺相关病毒载体，其中所述载体为pAGX(+)。
3．权利要求1所述的腺相关病毒载体，其中所述载体为pAGX(-)
4．权利要求1-3任一项所述的腺相关病毒载体，其中载体上可用于克隆的限制性内切酶位点包括HindⅢ、BstⅪ、NotⅠ、XbaⅠ和ApaⅠ。
5．权利要求1所述载体的制备方法，方法包括A．用HindⅢ和XbaⅠ酶切质粒pSub201，回收含有末端反转重复序列的片段；B．用NruⅠ和SalⅠ酶切质粒pRc/CMV，回收含有CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因的片段；C．回收的片段经Klenow酶补平，藉DNA连接酶进行连接；D．连接后的产物转化大肠杆菌，筛选阳性克隆。
6．权利要求5所述的方法，其中酶切后的片段经凝胶纯化并回收。
7．权利要求5所述的方法，其中补平的片段经去磷酸化处理，藉T4 DNA连接酶进行连接。
8．权利要求1所述的载体在介导目的基因转入真核动物细胞中的用途，包括A．将目的基因插入腺相关病毒载体的多克隆位点；B．在宿主细胞内包装并拯救带有目的基因的重组腺相关病毒载体；C．包装后的重组腺相关病毒载体转导真核动物细胞。
9．权利要求8所述的用途，其中包装是通过磷酸钙沉淀法，用辅助质粒pAAV/Ad与带有目的基因的重组腺相关病毒载体共同转染293细胞实现的。
10．权利要求8所述的用途，其中拯救是通过在共同转染过程中加入野生型腺病毒Ad5实现的。
11．权利要求8所述的用途，其中的真核动物细胞是哺乳动物细胞。
12．权利要求11所述的用途，其中的真核动物细胞是EB病毒转化的B细胞。
13．权利要求1所述的载体在建立体外细胞模型中的用途。
14．权利要求13所述的用途，其中的细胞是哺乳动物细胞。
15．权利要求13所述的用途，其中的细胞是EB病毒转化的B细胞。
全文摘要
本发明公开了一种腺相关病毒载体,该载体为7146bp的闭环质粒,其包含质粒pSub201的末端反转重复序列和质粒pRc/CMV的CMV启动子、多克隆位点、新霉素抗性基因。本发明还公开了用DNA重组技术制备腺相关病毒载体的方法以及这种载体在介导基因转移、建立体外细胞模型等方面的用途。经本发明的载体转入的基因可以在宿主细胞内长期稳定表达。
文档编号C12N7/01GK1322840SQ0111884
公开日2001年11月21日 申请日期2001年6月20日 优先权日2001年6月20日
发明者朱立平, 史耕先, 刘音, 赵方萄 申请人:中国医学科学院基础医学研究所