病毒诊断的制作方法

病毒诊断的制作方法
【专利摘要】本公开提供了用于确定受试者是否被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的方法。这些方法包括从对LCMV感染具有增加的易感性的受试者获得样品，使样品与一种或多种用于检测的组合物接触，并确定这一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明受试者被LCMV感染。
【专利说明】病毒诊断
[0001]相关专利申请
[0002]本专利申请要求获得2011年I月7日提交的美国临时专利申请N0.61/430,822的利益,本文通过援引并入该申请的全部内容。
【技术领域】
[0003]本公开涉及用于检测受试者体内病毒的组合物和方法。
[0004]背景
[0005]对于某些病毒，用于可靠检测和诊断的组合物和方法有限。用于区分急性和慢性病毒感染的技术也有限并且可能不太可靠。
[0006]概要
[0007]本公开提供了用于检测受试者体内淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)和/或区分急性和慢性LCMV感染的组合物和方法。因此，本公开可用于，例如，鉴定LCMV和为LCMV感染的治疗开发个性化疗法(例如为LCMV抗病毒疗法选择受试者，并监测，必要时修改LCMV抗病毒疗法)，降低LCMV扩散，减少宿主-宿主LCMV传播，减少LCMV疾病发展和致病，和评估LCMV病理状态。
[0008]因此，在一个方面中，本公开提供了一种用于确定受试者是否被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的方法，该方法包括:选择对LCMV感染具有增加的易感性的受试者；从受试者获得样品；使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触；和确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染。
[0009]在另一个方面中，本公开提供了一种用于确定受试者是否被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的方法，该方法包括:选择怀疑被LCMV感染的受试者；从受试者获得样品；使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触；和确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染。
[0010]在另外一个方面中，本公开提供了一种用于确定受试者是否被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的方法，该方法包括:从受试者获得样品；使样品与从下组选出的至少两种组合物接触:与一种或多种LCMV核酸、或一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的一种或多种探针或引物；一种或多种LCMV蛋白或其片段；和一种或多种用于检测LCMV肽或LCMV肽片段的组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段);和确定该两种或多种组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染。
[0011]在另外一个方面中，本公开提供了一种用于确定受试者是否被淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染的方法，该方法包括:选择正在经历缺氧或者有缺氧风险的受试者，从受试者获得样品；使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触；和确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染。[0012]在一些实施方案中，受试者可以是，例如，怀孕的、免疫受损的、移植接受者、具有发生癌症的风险，或者患有癌症，或者其任意组合。在一些实施方案中，受试者正在经历缺氧状态或者具有发生缺氧状态的风险。
[0013]在其它实施方案中，该一种或多种用于检测LCMV的组合物可以是与一种或多种LCMV核酸或一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的一种或多种探针或引物。
[0014]在另外的实施方案中，该一种或多种用于检测LCMV的组合物可以是一种或多种LCMV蛋白或其片段。
[0015]在另外的实施方案中，该一种或多种用于检测LCMV的组合物可以是用于检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的一种或多种组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段)。
[0016]在一个方面中，本公开提供了一种组合物，其包括两种或多种从下组选出的组合物:与一种或多种LCMV核酸或与一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的一种或多种探针或引物；一种或多种LCMV蛋白或其片段；和用于检测LCMV肽或LCMV肽片段的一种或多种组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段)。
[0017]在另一个方面中，本公开提供了一种诊断试剂盒，其中该试剂盒包括:至少一种分离的LCMV多肽或其片段，例如NP，GP, GPC, GPl或ZP抗原，或其片段。或者/并且，该试剂盒包括至少一种与NP，GP, GPC, GPl或ZP抗原结合的分离抗体或抗体片段，或其抗原结合片段。或者/并且，该试剂盒可包括至少一种与一种或多种LCMV核酸或其一部分，例如编码NP, GP, GPC, GPl或ZP抗原的核酸，特异性结合的探针或引物。在一些情况下，试剂盒可以包括上述的任意组合。
[0018]在另外一个方面中，本公开提供了多个分离的多肽，其中该多个多肽包括或者由选自下组的至少2种，例如3、4或5种类型的多肽构成:分离的NP抗原或其片段，分离的GP抗原或其片段，分离的GPC抗原·或其片段，分离的GPl抗原或其片段，分离的ZP抗原或其片段。在一些情况下，本公开提供了一种诊断试剂盒，包括这样的多个多肽。
[0019]在另外一个方面中，本公开提供了多个分离的抗体，例如单克隆或多克隆抗体，其中该多个抗体包括或者由与选自下组至少2种，例如3、4或5种类型多肽特异性结合的抗体构成:分离的NP抗原或其片段，分离的GP抗原或其片段，分离的GPC抗原或其片段，分离的GPl抗原或其片段，分离的ZP抗原或其片段。在一些情况下，本公开提供包括这样的多个抗体的诊断试剂盒，。
[0020]在另外一个方面中，本公开提供了多个分离的核酸探针或引物，其中该多个探针或引物包括或者由与编码选自下组的至少2种，例如3、4或5种类型多肽的核苷酸序列特异性结合的探针或引物构成:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，ZP抗原或其片段。在一些情况下，本公开提供包括这样的多种探针或引物的诊断试剂盒。
[0021 ] 在一些实施方案中，这里介绍的诊断试剂盒可以进一步包含用于治疗受试者体内的LCMV或其症状的作用剂，例如抗病毒剂。
[0022]在另外一个方面中，本公开提供了一种用于治疗受试者的LCMV感染的方法，包括:从患有或者具有被LCMV感染的危险的受试者获得生物样品；用上述诊断试剂盒、上述多个多肽、上述多个抗体、或上述多个探针或引物、或其任意组合筛查样品，以确定受试者是否被LCMV感染；以及如果患者被LCMV感染，则向受试者施用治疗LCMV或其症状的作用剂，例如抗病毒剂。在一些情况下，患有LCMV感染或者具有LCMV感染的风险的受试者具有涉及缺氧的状况。在一些情况下，患患有LCMV感染或者具有LCMV感染的风险的受试者是怀孕的、免疫受损的、移植接受者、具有癌症发生风险，或者患有癌症，或者其任意组合。
[0023]在另外的一个方面中，本公开提供了一种用于确定受试者是否被LCMV感染的方法，该方法包括:从患有LCMV感染或者具有被LCMV感染的风险的受试者获得生物样品；使样品与上述多个多肽、上述多个抗体、或上述个种探针或引物、或其任意组合接触；确定该多个多肽、多个抗体、多个探针或引物，或其任意组合是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明受试者被LCMV感染。
[0024]在另外一个方面中，本公开提供了一种单克隆抗体M59，其与LCMV NP特异性结合，或其抗原结合片段，例如互补决定区(CDR)，例如其CDR3。在一些情况下，本公开提供了包含这种抗体的试剂盒。
[0025]在另一个方面中，本公开提供了一种单克隆抗体M87，其与LCMV NP特异性结合，或其抗原结合片段，例如互补决定区(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情况下，本公开提供了包含这种抗体的试剂盒。
[0026]在另一个方面中，本公开提供了一种单克隆抗体，其与LCMV GPl特异性结合，或其抗原结合片段，例如互补决定区(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情况下，本公开提供了包含这种抗体的试剂盒。
[0027]在另一个方面中，本公开提供了一种单克隆或多克隆抗体，其与氨基酸序列RSGffGffAGSDGKTT(SEQ ID NO:89)特异性结合，或其抗原结合片段，例如互补决定区(CDR)，例如其⑶R3。在一些情况下，本公开提供了包含这种抗体的试剂盒。
[0028]在另一个方面中，本公开提供了一种单克隆抗体MJ3，其与LCMV ZP特异性结合，或其抗原结合片段，例如互补决定区(⑶R)，例如其⑶R3。在一些情况下，本公开提供了包含这种抗体的试 剂盒。
[0029]在一些方面中，本公开提供了用于评估(例如检测、确定、评估和/或监测)受试者体内淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染或活性的方法。这些方法可以包括选择用于评估的受试者，其中候选受试者曾暴露于或者被怀疑正暴露于LCMV或被LCMV感染的人或动物。该方法还包括从所选受试者获得或提供样品，使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触，并确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明受试者被LCMV感染。
[0030]在一些方面中，本公开提供了用于评估(例如检测、确定、评估和/或监测)受试者，例如被LCMV感染或者怀疑正暴露于LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或动物)的受试者体内淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些实施方案中，这些方法可以包括选择受试者(例如候选受试者)，从受试者获得或提供样品，使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触，和确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明受试者被LCMV感染。
[0031]在一些方面中，本公开提供了用于评估(例如检测、确定、评估和/或监测)受试者，例如被LCMV感染或者怀疑正暴露于LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或动物)的受试者体内淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些实施方案中，这些方法可以包括从受试者(例如合适的受试者)获得或提供样品，使样品与选自下组的至少两种组合物接触:与一种或多种LCMV核酸或一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的一种或多种探针或引物；一种或多种LCMV蛋白或其片段；和一种或多种用于检测LCMV肽或LCMV肽片段的组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段);和确定该两种或多种组合物是否与来自样品的LCMV标志相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染。
[0032]在一些方面中，本公开提供了用于评估(例如检测、确定、评估和/或监测)受试者，例如被LCMV感染或者怀疑正暴露于LCMV感染源(例如被LCMV感染的人或动物)的受试者体内淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，包括水平(例如LCMV核酸、蛋白和/或活性的水平)的方法。在一些实施方案中，这些方法可以包括，从受试者获得或提供样品，使样品与一种或多种用于检测LCMV的组合物接触，和确定该一种或多种用于检测LCMV的组合物是否与来自样品的LCMV标记相缔合，其中检测到缔合表明受试者被LCMV感染。
[0033]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括选择这样的受试者:受试者具有、或者有风险发生与增高的缺氧和/或自由基形成水平相关的状况。这些受试者包括，例如，怀孕的、免疫受损的、移植接受者、具有癌症发生风险，或者患有癌症。
[0034]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括本文公开的一种或多种组合物单独的应用或者与本文公开的其它组合物组合的应用。例如，两种或多种组合物的组合使用并不仅限于同时使用，还包括例如平行使用或顺次使用。在一些实施方案中，使用一种组合物观察到的结果可以用本文公开的一种或多种其它组合物加以确认。
[0035]在一些实施方案中，本公开的方法可包括一种或多种与一种或多种LCMV核酸或一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的探针或引物的应用。例如，这些探针或引物可以包括具有10种或更多种核酸的核酸探针或引物，其中该10种或更多种核酸与SEQ IDNO: 1-51中一个或多个内的一个或多个靶区域具有至少80%的同一性，从而使该一种或多种核酸探针或引物可与该一个或多个靶区域特异性结合。
[0036]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括从下组选出的一种或多种探针或引物，该组包括一种或多种与SEQ` ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73 中一个或多个具有至少 80% 同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开的方法可以包括从下组选出的一种或多种探针或引物:SEQ ID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ IDNO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ ID NO:70，SEQ IDNO:71, SEQ ID NO:72, SEQ ID N0:73。
[0037]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括一种或多种与编码LCMV NP的核酸结合的探针或引物的应用。例如，这些探针或引物可以包括:SEQ ID NO:58和59，或与SEQ IDNO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 66和67，或与SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0038]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括一种或多种与编码LCMV GP的核酸结合的探针或引物的应用。例如，这些探针或引物可以包括:SEQ ID N0:60和61，或与SEQID N0:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:68和69，或与SEQ IDNO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0039]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括一种或多种与编码LCMV ZP的核酸结合的探针或引物的应用。例如，这些探针或引物可以包括:SEQ ID NO:62和63，或与SEQ IDNO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 72和73，或与SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0040]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括一种或多种与编码LCMV L的核酸结合的探针或引物的应用。例如，这些探针或引物可以包括:SEQ ID NO: 70和71，或与SEQ IDNO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0041]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括编码LCMV NP, LCMV GP，LCMV ZP和LCMV L中两个或多个的核酸的应用。
[0042]在一些实施方案中，本公开的方法可以包括下列的应用:SEQ ID N0:58和59，或与SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 66和67，或与SEQID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMV NP结合；SEQ IDN0:60和61，或与SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:68和69，或与SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMVGP结合，SEQ ID NO: 62和63，或与SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 72和73，或与SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMV ZP结合；或者SEQ ID NO: 70和71，或与SEQ ID NO: 70和71具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMV L结合。
[0043]在一些实施方案中，本公开的方法可包括一种或多种LCMV蛋白或其片段的应用。
[0044]在一些实施方案中，本公开的方法包括一种或多种抗体或抗体片段的应用。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤MJ3具有相同的表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM),以及与杂交瘤M166具有相同的表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在比利时Ghent大学的寄比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，和由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括单克隆抗体M87重链可变区的⑶R3(SEQ ID N0:78)，其不包含(例如包含O个)或至少I个(例如1、2、3、4、5、少于10个、少于20个、少于30个、少于50个、或少于100个)保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的⑶R2(SEQID NO: 77)，其不包含(例如包含O个)或至少I个(例如1、2、3、4、5、少于10个、少于20个、少于30个、少于50个、或少于100个)保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDRl (SEQ ID NO: 76)，其不包含(例如包含O个)或至少I个(例如1、2、3、4、5、少于10个、少于20个、少于30个、少于50个、或少于100个)保守氨基酸替换。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与SEQ ID NO:74具有同一性的抗原结合肽(例如包括抗体和/或抗原结合性抗体片段)，其中相应于SEQ ID N0:74互补决定区氨基酸序列内的区域包含一个或多个保守氨基酸替换，相应于SEQ ID NO: 74框架区氨基酸序列内的区域与SEQID NO:74的相应区域具有至少80%的同一性，和/或抗原结合肽与LCMV NP结合。
[0045]在一些方面中，本公开包括含有如下的组合(例如包含其中1、2或3种)的组合物:与一种或多种LCMV核酸或一种或多种LCMV核酸的一部分特异性结合的一种或多种探针或引物；一种或多种LCMV蛋白或其片段；和一种或多种抗体或抗体片段。在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物可以包括一种或多种这样的核酸探针或引物:其具有10种或更多种核酸，其中该10种或更多种核酸与SEQ ID NO: 1-51中一个或多个中的一个或多个靶区域具有至少80%同一性，从而使该一种或多种核酸探针或引物可与该一个或多个靶区域特异性结合。在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物选自下组:一个或多个与 SEQ ID NO:58，SEQ ID NO:59，SEQ ID NO:60，SEQ ID NO:61, SEQID NO:62，SEQ ID NO:63，SEQ ID NO:66，SEQ ID NO:67，SEQ ID NO:68，SEQ ID NO:69，SEQ IDNO:70, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO:72, SEQ ID NO: 73 中一个或多个具有至少80% 同一性的核酸序列。在一些实施方案中，组合物的一种或多种探针或引物选自下组:SEQ ID NO:58, SEQID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72, SEQID NO: 73。在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV NP的核酸结合的一种或多种探针或引物。在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括从下组选出的一种或多种探针或引物:SEQ ID N0:58和59或与SEQ ID NO:58和59具有至少80%同一性的核酸·序列对；或SEQ ID NO:66和67或与SEQ ID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0046]在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV GP的核酸结合的一种或多种探针或引物。例如，这样的探针或引物可包括:SEQ ID N0:60和61或与SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:68和69或与SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0047]在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV ZP的核酸结合的一种或多种探针或引物。例如，这样的探针或引物可包括:SEQ ID N0:62和63或与SEQ ID NO:62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:72和73或与SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0048]在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV L的核酸结合的一种或多种探针或引物。例如，这样的探针或引物可包括:从下组选出的一种或多种探针或引物:SEQ ID N0:70和71或与SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对。[0049]在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV GP的核酸结合的一种或多种探针或引物。例如，这些探针或引物可以包括一种或多种与编码LCMV NP, LCMV GP, LCMV ZP和/或LCMV L中两者或更多者的核酸结合的探针或引物。
[0050]在一些实施方案中，这里的组合物的一种或多种探针或引物包括与编码LCMV GP的核酸结合的一种或多种探针或引物。例如，这些探针或引物可以包括这样的一种或多种探针或引物，其包括:SEQ ID N0:58和59或与SEQ ID NO:58和59具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:66和67或与SEQ ID NO:66和67具有至少80%同一性的核酸序列对，其中该引物与LCMV NP结合；SEQ ID NO:60和61或与SEQ ID N0:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID N0:68和69或与SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列对，其中该引物与LCMV GP结合；SEQ ID NO: 62和63或与SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:72和73或与SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列对，其中该引物与LCMV ZP结合；或SEQ ID NO: 70和71或与SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对，其中该引物与LCMV L结合。
[0051]在一些方面中，本公开包括包含一种或多种抗体的组合物。在一些实施方案中，本公开组合物中包含的抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghen t大学的比利时微生物保藏中心(BCCM);以及与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，以及由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，这些抗体或抗体片段可以包括单克隆抗体M87重链可变区的CDR3(SEQID N0:78)，其中包含I个或多个保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的⑶R2(SEQ ID NO: 77)，其中包含I个或多个保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的⑶Rl (SEQ ID NO: 76)，其中包含I个或多个保守氨基酸替换。
[0052]在一些实施方案中，本公开的组合物中包含的抗体或抗体片段可以包括单克隆抗体M87重链可变区的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDR2 (SEQID NO:77)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDRl (SEQ ID NO:76)。
[0053]在一些实施方案中，本公开的组合物中包含的抗体或抗体片段可以包括与SEQ IDNO: 74具有同一性的抗原结合肽(例如包括抗体和/或抗原结合性抗体片段)，其中:氨基酸序列内对应于SEQ ID NO: 74内的互补决定区的的区域包含一个或多个保守氨基酸替换，氨基酸序列内对应于SEQ ID NO:74框架区的区域与SEQ ID NO:74中的相应区域具有至少80%的同一性，并且所述抗原结合肽与LCMV NP结合。
[0054]在一些方面中，本公开包括诊断试剂盒。在一些实施方案中，这些诊断试剂盒可包括，至少一种分离的LCMV多肽或其片段，其中LCMV多肽是NP，GP或ZP抗原，或其片段；一种或多种与NP，GP或ZP抗原结合的分离抗体或抗体片段，或其抗原结合片段；和/或与一种或多种LCMV核酸或其一部分特异性结合的一种或多种探针或引物；和/或其组合。
[0055]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒可包括一种或多种探针或引物，其包含一种或多种具有10个或更多个核酸的核酸探针或引物，其中该10个或更多个核酸与SEQID NO: 1-51中一个或多个序列中的一个或多个靶区域具有至少80%的同一性，从而使该一种或多种核酸探针或引物能够与该一个或多个靶区域特异性结合。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括从下组选出的探针和引物:一种或多种与SEQID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQID NO:72, SEQ ID NO:73中的一个或多个具有至少80%同一性的核酸序列。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括从下组选出的探针和引物:SEQ IDNO:58, SEQ ID NO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ IDNO:66, SEQ ID NO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ IDNO:72，SEQ ID NO:73。
[0056]在一些实施方 案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括与编码LCMVNP的核酸结合的探针或引物。在一些实施方案中，这些探针或引物可以包括:例如，SEQ IDNO: 58和59，或与SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 66和67，或与SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0057]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物可包括与编码LCMVGP的核酸结合的探针或引物。在一些实施方案中，这些探针或引物可以包括:例如，SEQ IDN0:60和61，或与SEQ ID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:68和69，或与SEQ ID NO: 68和69具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0058]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物可包括与编码LCMVZP的核酸结合的探针或引物。在一些实施方案中，这些探针或引物可以包括:例如，SEQ IDNO: 62和63，或与SEQ ID NO: 62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 72和73，或与SEQ ID NO: 72和73具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0059]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括与编码LCMV L的核酸结合的探针或引物。在一些实施方案中，这些探针或引物可以包括:例如，SEQ IDNO:70和71，或与SEQ ID N0:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对。
[0060]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括与编码LCMVNP, LCMV GP, LCMV ZP和LCMV L中两个或多个的核酸结合的一种或多种探针或引物。
[0061]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的探针或引物包括如下的一种或多种:SEQ ID NO: 58和59，或与SEQ ID NO: 58和59具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 66和67，或与SEQ ID NO: 66和67具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMV NP结合，SEQ ID NO: 60和61，或与SEQ ID NO: 60和61具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO: 68和69，或与SEQ ID NO: 68和69具有至少80%同一性的核酸序列对，其中所述引物与LCMV GP结合，SEQ ID NO:62和63，或与SEQ ID N0:62和63具有至少80%同一性的核酸序列对；或SEQ ID NO:72和73，或与SEQ ID N0:72和73具有至少80%同一性的核酸序列对，其中引物与LCMV ZP结合；或者SEQ ID N0:70和71，或与SEQ ID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对，其中引物与LCMV L结合。
[0062]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒包括一种或多种分离的抗体或抗体片段。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括:与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时(ihent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，和与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括:由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，和由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0063]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括单克隆抗体M87重链可变区的⑶R3 (SEQ ID NO: 78)，其中包含一个或多个保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDR2(SEQ ID NO: 77)，其中包含一个或多个保守氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDRl (SEQ ID NO: 76)，其中包含一个或多个保守氨基酸替换。
[0064]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包含单克隆抗体M87重链可变区的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDR2 (SEQ ID NO: 77)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDRl (SEQ ID NO: 76)。
[0065]在一些实施方案中，本公开的诊断试剂盒中含有的分离抗体或抗体片段可以包括与SEQ ID N0:74具有同一性的抗原结合肽(例如抗体或抗原结合性抗体片段)，其中:氨基酸序列内相应于SEQ ID NO: 74的互补决定区的区域包含一个或多个保守氨基酸替换，氨基酸序列内相应于SEQ ID NO:74的框架区的区域与SEQ ID NO:74的相应区域具有至少80%的同一性，和/或该抗原结合肽与LCMV NP结合。
[0066]在一些方面中，本公开包括分离的多肽的群体，其中所述群体包括从下组选出的至少两个多肽:分离的NP抗原或其片段，分离的GP抗原或其片段，分离的GPC抗原或其片段，分离的GPl抗原或其片段，和分离的ZP抗原或其片段。在一些实施方案中，本公开的群体可以包括:至少三个从下组选出的多肽:分离的NP抗原或其片段，分离的GP抗原或其片段，分离的GPC抗原或其片段，分离的GPl抗原或其片段，和分离的ZP抗原或其片段，至少四个从下组选出的多肽:分离的NP抗原或其片段，分离的GP抗原或其片段，分离的GPC抗原或其片段，分离的GPl抗原或其片段，和分离的ZP抗原或其片段。在一些实施方案中，这样的群体可以作为试剂盒提供或者包含在试剂盒中。
[0067]在一些方面中，本公开包括分离的抗体或抗体片段的群体，其中所述群体包括与至少两个选自下组的多肽特异性结合的抗体或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0068]在一些方面中，本公开包括分离的抗体或抗体片段的群体，其中所述群体包括与至少三个选自下组的多肽特异性结合的抗体或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0069]在一些方面中，本公开包括分离的抗体或抗体片段的群体，其中所述群体包括至少四个与选自下组的多肽特异性结合的抗体或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0070]在一些方面中，本公开包括分离的抗体或抗体片段的群体，其中该群体包括特异性结合下述的抗体或片段:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。
[0071]在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施`方案中，本公开的抗体群体可包括与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB。在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，和与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)，和由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0072]在一些实施方案中，本公开的抗体群体可包括与SEQ ID NO:74具有同一性的抗原结合肽，其中:相应于SEQ ID NO:74互补决定区氨基酸序列内的区域包含一个或多个保守氨基酸替换，相应于SEQ ID NO:74框架区氨基酸序列内的区域与SEQ ID N0:74的相应区域具有至少80%的同一性，和/或所述抗原结合肽与LCMV NP结合。
[0073]在一些方面中，本公开的抗体群体可以作为诊断试剂盒提供(例如销售、许诺销售、上市、运输、储存和/或包装)或者包含在诊断试剂盒内。
[0074]在一些方面中，本公开的抗体群体可以包括与编码至少两种从下组选出的多肽的核苷酸序列特异性结合的探针或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公开的抗体群体可以包括与编码至少三种从下组选出的多肽的核苷酸序列特异性结合的探针或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公开的抗体群体可以包括与编码至少四种从下组选出的多肽的核苷酸序列特异性结合的探针或引物:NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段。在一些方面中，本公开的抗体群体可以包括与编码NP抗原或其片段，GP抗原或其片段，GPC抗原或其片段，GPl抗原或其片段，和ZP抗原或其片段的核苷酸序列特异性结合的探针或引物。
[0075]在一些方面中，本公开的抗体群体可以作为诊断试剂盒提供(例如销售、许诺销售、上市、运输、储存和/或包装)或者包含在诊断试剂盒内。在一些实施方案中，这些诊断试剂盒可以进一步包括至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种)用于治疗受试者体内的LCMV或其症状的作用剂(例如药物)。在一些实施方案中，至少一种这样的作用剂是抗病毒剂。[0076]在一些实施方案中，本公开提供了用于治疗受试者体内LCMV感染的方法，包括:从具有LCMV感染或有LCMV感染风险的受试者获得生物样品；使用权利要求1的方法筛选样品以确定受试者是否被LCMV感染；和如果患者被LCMV感染，给受试者施用用于治疗LCMV或其症状的作用剂。在一些实施方案中，本公开的治疗方法可以包括选择的具有LCMV感染或有LCMV感染风险受试者具有涉及缺氧的病症。这些受试者可以包括例如怀孕的、免疫受损的、移植接受者、和具有发生癌症风险的，或者患有癌症的。
[0077]在一些方面中，本公开提供了单克隆抗体M59，其与LCMV NP或其片段特异性结
口 ο
[0078]在一些方面中，本公开提供了单克隆抗体M87，其与LCMV NP或其片段特异性结
口 O
[0079]在一些方面中，本公开提供了单克隆抗体，其与LCMV GPl或其片段特异性结合。
[0080]在一些方面中，本公开提供了单克隆抗体，其与氨基酸序列RSGWGWAGSDGKTT(SEQID NO:89)特异性结合。
[0081]在一些方面中，本公开提供了单克隆抗体MJ3，其与LCMV ZP或其片段特异性结
入
口 ο
[0082]在一些方面中，本公开提供了本文中公开的一种或多种抗体的互补决定区(CDR)。在一些实施方案中，该⑶R是⑶R3。
[0083]在一些方面中，本文公开的一种或多种抗体或抗体结合片段本公开的抗体群体可以作为诊断试剂盒提供(例如销售、许诺销售、上市、运输、储存和/或包装)或者包含在诊断试剂盒内。
[0084]在一些方面中，本公开提供了与杂交瘤MJ3具有相同表位特异性的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0085]在一些实施方案中，本公开提供了由杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0086]在一些实施方案中，本公开提供了杂交瘤MJ3细胞，MJ3的LMBP保藏号为9217CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0087]在一些实施方案中，本公开提供了与杂交瘤M166具有相同表位特异性的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0088]在一些实施方案中，本公开提供了由杂交瘤M166产生的单克隆抗体，M166的LMBP保藏号为9216CB，并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0089]在一些实施方案中，本公开提供了杂交瘤M166细胞，M166的LMBP保藏号为9216CB,并保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)。
[0090]在一些实施方案中，本公开提供了一种分离的抗体或抗体片段，包括单克隆抗体M87重链可变区的⑶R3(SEQ ID NO: 78)，其包含一个或多个保守的氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的⑶R2(SEQ ID NO: 77)，其包含一个或多个保守的氨基酸替换，和/或单克隆抗体M87重链可变区的⑶Rl (SEQ ID NO: 76)，其包含一个或多个保守的氨基酸替换。
[0091]在一些方面中，本公开提供了一种分离的抗体或抗体片段，包括单克隆抗体M87重链可变区的CDR3(SEQ ID NO: 78)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDR2 (SEQ IDNO:77)，和/或单克隆抗体M87重链可变区的CDRl (SEQ ID NO:76)。
[0092]在一些方面中，本公开提供了一种与SEQ ID NO:74具有同一性的抗原结合肽(例如包括抗体和/或抗原结合性抗体片段)，其中:相应于SEQ ID NO: 74互补决定区氨基酸序列内的区域包含一个或多个保守氨基酸替换，相应于SEQ ID NO:74框架区氨基酸序列内的区域与SEQ ID NO: 74的相应区域具有至少80%的同一性，和与LCMV NP结合的抗原结合肽。
[0093]除非另外定义，否则这里所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属【技术领域】普通技术人员所公知的相同的意义。这里介绍了用于本发明的方法和材料；也可以使用本【技术领域】已知的其它合适的方法和材料。材料、方法和实施例仅是出于举例的目的，没有限制意义。本文引用在这里提到的全部出版物、专利申请书、专利、序列、数据库和其它参考的全部内容作为参考。在发生冲突时，以本专利说明书，包括定义，为准。
[0094]通过下面的详细说明和图表以及权利要求，本发明的其它特征和优势将变得显而易见。
【专利附图】

【附图说明】
[0095]图1A显示了 LCMV的结构，包括外跨膜糖蛋白I和2 (GPl和GP2)、LCMV病毒粒的Z蛋白、NP、RNA和L蛋白，和病毒复制策略。
[0096]图1B是图解LCMV生命周期的示意图。
[0097]图2 (即图2i_2vi)显示了所选LCMV病毒株/分离株S节段上NP基因组区域核苷酸序列的比对。
[0098]图3 (即图3i_3vi)显示了所选LCMV病毒株/分离株S节段上GP (即GPC，包括GPl和GP2)基因组区域核苷酸序列的比对。[0099]图4显示了所选LCMV病毒株/分离株L节段上ZP基因组区域核苷酸序列的比对。
[0100]图5(即图5i_5ii)显不了所选LCMV病毒株/分尚株NP抗原氨基酸序列的比对。
[0101]图6(即图6i_6ii)显不了所选LCMV病毒株/分尚株GP抗原氨基酸序列的比对。
[0102]图7显示了所选LCMV病毒株/分离株ZP抗原氨基酸序列的比对。
[0103]图8A-8D显示了用于本文公开方法的示例性基于抗体的测定。
[0104]图9显示了用于本文公开方法的示例性的基于RNA的测定。
[0105]图1OA是显示氧上调LCMV基因表达的图表。诱导倍数通过与正常氧对照比较确定。数值代表3次独立实验每次4个重复样品的平均值。误差线代表标准差。*Ρ〈0.02，_P〈0.001 (缺氧(HY) vs.正常氧(NO))。
[0106]图1OB是显示了 DMOG处理上调LCMV基因表达的图表。数值代表两次实验中一个代表性实验三次重复确定的平均值，误差线指示标准差。*p〈0.05, ***P〈0.001 (DM0G对无DMOG)ο
[0107]图1OC是免疫印迹的图，显示了缺氧上调LCMV蛋白表达。肌动蛋白显示作为上样和转移效率的对照。检测到HIF-1alpha作为诱发对缺氧的细胞响应的对照。显示了至少三次具有相似结果的独立实验的一个代表性结果。
[0108]图1OD是显示通过RLM-RACE评估得到的在正常氧和缺氧条件下各种LCMV基因的相对表达水平的柱状图。
·[0109]图1lA是凝胶图像，通过RT-PCR检测确认了在正常氧(NO)条件下培养的HeLa-MX细胞的培养基中和在缺氧(HY)条件下培养的细胞的培养基中存在LCMV基因组。
[0110]图1lB是凝胶图像，通过RT-PCR评估显示了用来自第(P)l、P3、P5和PlO代的HeLa-MX细胞的培养基感染的细胞中的LCMV基因表达。
[0111]图1lC是用来自HeLa-MX细胞的培养基感染的细胞的图像。对细胞染色以鉴定LCMV。还使用了细胞核染色。细胞在P1、P3和PlO代被染色。使用的放大倍数为20倍。数据代表了两次独立的实验。
[0112]图12A是显示用于表征抗体重链可变区序列的操作规程的示意图。
[0113]图12B显示了单抗M87重链可变区的氨基酸序列。黄色阴影指示信号肽序列。绿色阴影指示高变区。
[0114]图12C图解了单抗M87重链的结构。
[0115]图13是免疫印迹图像，确认了在发生自然流产的妇女的血清中存在抗NP抗体。通过免疫沉淀检测了人血清中的抗-NP抗体。
[0116]图14的图像显示了肾肿瘤中(图14A)和阴性对照中(图14B)病毒NP的免疫组化检测结果。
[0117]图14C是免疫印迹图像显示了通过用NP特异性单克隆抗体进行免疫检测和随后的免疫印迹在来自人RCC受试者的组织中进行LCMV的免疫检测。HT=健康组织，TT=肿瘤组织，HMX=HeLa/MX (阳性对照)，H=HeLa (阴性对照)。
[0118]图15A和15B的图片图解了 M87和M59抗体之间竞争性结合研究的结果。
[0119]图16是显示NP特异抗体与NP片段的表位结合的线图。
[0120]图17是显示纯化重组蛋白的SDS-PAGE分析的凝胶图像。泳道I，纯化的LCMV NP抗原；泳道2，纯化的阴性对照抗原。检测到一条大约为62kDa的LCMV NP抗原蛋白条带(泳道I)。
[0121]图18A-18B是显示LCMV PCR产物的电泳的琼脂糖凝胶图像。
[0122]图19A-19B是显示单链体模式(singl印lex format)的LCMV MX NP和GP基因的实时检测的线图。
[0123]图20显示了双链体模式(duplex format)的LCMV MX NP和GP基因的实时检测的线图。
[0124]图21A-21B是显示单链体模式的LCMV ARM NP和GP基因的实时检测的线图。
[0125]图22是显示双链体模式的LCMV ARM NP和GP基因的实时检测的线图。
[0126]图23A-23D是显示LCMV实时PCR测定的灵敏度的线图。掺入有系列稀释的LCMV感染细胞的血液样品通过实时PCR测定加以检测，图23A，图23B为单链体模式，图23C，23D为双链体模式。
[0127]图24是显示通过实时PCR评估的缺氧和正常氧条件下的LCMV MX NP和GP基因表达的柱状图。
【具体实施方式】
[0128]本公开是基于但不限于一个令人惊讶的发现，即持续感染的LCMV可以被缺氧重新激活。这种病毒重新激活可以在临床上有表现，例如在易感的受试者中表现，这样的受试者体内，包括但不仅限于，怀孕的受试者、免疫受损的受试者、移植接受者和具有发生癌症的危险或者患有癌 症的受试者。因此，本公开提供了用于可靠地检测LCMV，例如重新激活的LCMV，的组合物和方法。
[0129]淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)是沙粒病毒科(Arenaviridae)的一种原型成员，具有带包膜的病毒粒子和双节段的(bisegmented)单链RNA基因组(见图1)。两个节段(小[S]和大[L])均包含两个沿着彼此相反方向的开放阅读框，采用双义(ambisense)编码策略(Meyer et al，2002)。S RNA编码一个主要的病毒蛋白核蛋白(NP)和一个糖蛋白前体(GP-C)，其被共翻译地裂解成周糖蛋白I (GPl)和跨膜糖蛋白2 (GP2) (Southern etal, Virology, 157 (I): 145-55 (1987) )。L RNA 节段编码 RNA 依赖的 RNA 聚合酶(L)和调节环指 Z 蛋白(ZP) (Buchmeier Curr Top Microbiol Immunol.262:159-73 (2002) ; Salvato,Virologyl73, 1-10(1989))。
[0130]病毒复制开始是在L聚合酶驱动下转录负极性的3’ RNA基因组臂，产生mRNA，mRNA随后被翻译成NP和L聚合酶。这些病毒蛋白质有助于将RNA基因组转录成病毒cRNA，病毒cRNA作为合成新基因组RNA分子的模板，以及翻译成GPC和ZP的亚基因组mRNA的模板。这种两阶段复制策略有助于建立病毒持续感染(virus persistence),该状态能够在由于糖蛋白不表达或者表达有限而导致不存在成熟病毒颗粒产生的情况下，借助由NP、RNA基因组和L聚合酶构成的病毒核糖核蛋白得以保持(van der Zeijst et al, J Virol48:249-61(1983) ;Buchmeier, 2003)。LCMV可以在各种各样的来自不同物种的细胞类型中容易地建立持续性感染，在这些细胞中它并不干扰重要的细胞功能，但是可调变非必需的表型特征(Oldstone, Curr Top Microbiol Immunol.263:83-117 (2002) ; Peters et al,同上)。
[0131]由于LCMV与啮齿动物物种小家鼠关联，因此在世界上广泛分布。人一般通过直接或间接与被感染的啮齿类动物或宠物接触，而通过呼吸道感染(通过吸入被病毒污染的动物唾液，尿液和粪便的气溶胶)。在免疫功能正常的个体中，LCMV从轻度流感样症状到罕见严重脑炎(Jahrling and Peters, 1992, Buchmeier et al, 2007)的各种不同病状。已经有人将怀孕期间的该种病毒感染与自然流产和畸形联系起来(Jamieson et al, 2006, Meritetet al，2009)。更引人注目的是，最近报道了从受感染的供体向免疫受损的受体通过器官移植传播的LCMV感染导致死亡的案例，唤起了人们对这种看似无害病毒的更大关注(Fischer et al, 2006, Amman et al，2007)。
[0132]急性感染涉及产生成熟的GPl和GP2，而慢性/持续感染显示产生不成熟的GPC，但是成熟形式的糖蛋白缺少或者降低，NP在急性和慢性/持续状态下均产生，类似地，ZP在急性和慢性/持续状态下均产生，但是其表达在被缺氧重新激活时提高(Buchmeier, 2003, Tomaskova et al,未公开数据)。这个事实在先前检测LCMV的尝试中被忽视了，但是最近我们的研究数据重新唤醒了对它的注意:我们的数据显示GP，NP和ZP的产生和感染病毒粒子的形成响应缺氧而相对提高，而缺氧与许多生理和病理状态有关，包括胚胎发育、心脏和脑缺血、癌症等。而且，LCMV “重新激活”已知会由于免疫抑制(出于移植目的，由于化疗和其它情况下)而发生，并且也很可能与病毒GP，NP和ZP的表达提高有关。 [0133]迄今为止，没有可靠的用于LCMV检测、筛选和诊断LCMV急性和/或慢性感染的方法用于临床实验的常规应用，要进行筛选/诊断的目标(危险)人群还没有得到确定，因为缺少全面的流行病学数据。现有的测定法(包括例如免疫荧光、ELISA、补体结合反应和RT PCR测定)没有显示足够的灵敏性和可重复性，不能区分急性和慢性/持续感染，并且仅在暴发疫情或当其它病毒不能检出时才偶尔采用。而且，现有测定一般不会组合NP，GP, ZP(或GCP和GPl)和ZP衍生的寡核苷酸或多肽检测病毒和/或病毒特异性抗体，因此很可能无法检出许多LCMV感染病例，即使当感染已通过其他方式被证明时也是如此。因此，非常需要获得精确、灵敏和可重复的常规测定方法。
[0134]用于检测LCMV的组合物
[0135]本公开包含的组合物包括能够特异检测生物样品中的一种或多种LCMV标记的生物和合成材料。
[0136]LCMV的标志物包括，例如，一种或多种或至少一种(例如1、2、3、4、5或更多种，包括2、3、4或5种的组合)LCMV核酸(例如LCMV mRNA和/或LCMV基因组DNA/RNA，例如编码一种或多种LCMV肽(例如LCMV GP(1和/或2)、Z蛋白、NP和/或L蛋白)的LCMV DNA),和/或LCMV蛋白或肽(例如I, 2，3，4，5或更多种，包括2、3、4或5种LCMV GP (I和/或2)、Z蛋白、NP和/或L蛋白的组合)。例如，在一些情况下，LCMV的标志物可以包括LCMV GP和/或LCMV NP核酸和/或蛋白。在一些情况下，LCMV的标志物可以包括标志物的部分，或者可以通过靶定标志物的部分加以检测。在一些情况下，LCMV标志物的部分可以包括，例如，在一种或多种LCMV病毒株或分离株中保守的核酸区域。例如，用于检测的合适部分可以包括在图2-4中被鉴定为保守的区域(例如在SEQ ID NO: 1-57的一个或多个中)。或者/并且，合适的部分可以包括与一种或多种LCMV病毒株的区域有至少50%同一性(例如，50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)的 LCMV 核苷酸区域(例如在 SEQID NO: 1-57的一个或多个中)。在一些情况下，合适的部分可以包括与由SEQ ID NO: 1-57的一个或多个编码的蛋白区域有至少50%同一性(例如，50%，60%, 70%, 80%, 85%，90%, 95%，98%，99%，或100%同一性)的LCMV蛋白区域。在一些情况下，合适的部分可以包括与SEQID NO: 52-57的一个或多个内的区域有至少50%同一性(例如，50%，60%, 70%, 80%, 85%, 90%,95%，98%，99%，或100%同一性)的LCMV蛋白区域。
[0137]适合于特异检测这些一种或多种或者至少一种LCMV核酸或其部分的组合物可以包括，但不仅限于，核酸探针或引物。用于设计和合成合适探针或引物的方法是本领域已知的。在一些情况下，能够用于检测一种或多种或者至少一种LCMV标志物的核酸探针或引物可以包括含有例如10种或更多种核酸(例如10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，35，40，45，50，55，60，70，75，80，85，90，95，100，200，300，400，500，600, 700, 800, 900, 1000，或更多种核酸)核酸探针或引物，例如，其中该10种或更多种核酸与一种或多种LCMV标志物内(例如在SEQ ID NO: 1_51的一个或多个内)的靶区域具有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)，从而使该核酸探针或引物与靶区域(例如在SEQ ID NO: 1-51的一个或多个内)特异性结合。在一些情况下，该探针或引物能够在严格结合条件(例如低严格性、中严格性或高严格性)下结合(例如特异性结合)靶区域。符合低、中和高严格杂交条件的杂交条件在本领域是已知的。本领域中理解的是，能够特异性杂交的互补的核酸序列不需要与其靶核酸100%互补。当本发明的互补核酸序列或其部分与靶序列发生结合，从而使得靶部分的扩增能够发生时，则本发明的互补核酸序列是能够特异杂交的。在一些情况下，可以使用多种探针或引物检测样品(术语“样品”或“ 生物样品”是指从受试者(人或动物)获得的组织或体液样品)中的同一 LCMV核酸，所述包括但不仅限于，血液、血清、血浆、活组织检查和手术样品、唾液、尿液、脑脊液等。生物样品还包括体外培养细胞和培养基。样品可以在分析之前通过加热、离心、沉淀等加以处理)中的相同LCMV核酸。在这些情况下，探针能检测同一 LCMV核酸的重叠部分，或者它们能够检测同一 LCMV核酸的非重叠部分。或者/并且，可以使用多种探针或引物检测样品中的不同LCMV核酸。在一些情况下，可用于检测一种或多种或至少一种LCMV标志物的核酸探针或引物可以包括，例如，如下的一种或多种或至少一种:SEQ ID NO:58, SEQID N0:59(例如 SEQ ID N0:58 和 59 的组合，其检测 LCMV NP), SEQ ID NO:60, SEQ IDNO: 61 (例如 SEQ ID NO:60-61 的组合，其检测 LCMV GP)，SEQ ID NO: 62，SEQ ID N0:63(例如 SEQ ID N0:62-63 的组合，其检测 LCMV ZP)，SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:67(例如 SEQ IDN0:66-67 的组合，其检测LCMV NP)，SEQ ID NO:68, SEQ ID N0:69(例如 SEQ ID NO:68-69的组合，其检测 LCMV GP), SEQ ID NO: 70，SEQ ID NO: 71 (例如 SEQ ID NO: 70-71 的组合，其检测 LCMV L), SEQ ID NO: 72，SEQ ID NO: 73 (例如 SEQ ID NO: 72-73 的组合，其检测 LCMVZ)。在一些情况下，可用于检测一种或多种或至少一种LCMV标志物的核酸探针或引物可以包括与如下的一种或多种具有至少50%(例如50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%，98%, 99%和100%)序列同源性或同一性的核酸探针或引物:SEQ ID NO: 58和59的组合，其检测 LCMV NP) ；SEQ ID NO:60, SEQ ID N0:61(例如 SEQ ID N0:60_61 的组合，其检测LCMV GP) ；SEQ ID NO:62, SEQ ID N0:63(例如SEQ ID N0:62_63 的组合，其检测LCMV ZP)；SEQ ID NO:66, SEQ ID N0:67(例如 SEQ ID NO:66-67 的组合，其检测 LCMV NP), SEQ IDNO:68, SEQ ID N0:69(例如SEQ ID N0:68_69 的组合，其检测LCMV GP) ；SEQ ID NO:70, SEQID N0:71(例如SEQ ID N0:70_71 的组合，其检测LCMV L) ；SEQ ID NO:72, SEQ ID NO:73(M如SEQ ID NO: 72-73的组合，其检测LCMV Z)。在一些情况下，可用于检测一种或多种或至少一种LCMV标记的核酸探针或引物可以包括本文实施例21中描述的探针或引物中的一种或多种。
[0138]在一些情况下，适合于检测一种或多种或至少一种LCMV核酸或其部分的方法可以包括例如RT-PCR和/或RLM-RACE (例如如本文实施例2中所述)。
[0139]或者/并且，LCMV的标志物可以包括一种或多种LCMV肽(例如包括多肽或蛋白)，并且用于检测LCMV的方法可以包括例如检测一种或多种LCMV肽。
[0140]术语“多肽”和“蛋白”是指氨基酸残基的聚合物或寡聚体，包括全长蛋白、片段、肽、寡肽、多聚体等。该术语还包括翻译后修饰(糖基化、磷酸化、乙酰化等)，以及对天然序列(自然突变体和变异体)的缺失、添加、替换、突变)，例如只要该产物保持期望的活性即可),例如本文中公开的一种或多种LCMV肽。
[0141]在一些情况下，LCMV肽可以是全长LCMV肽或LCMV肽的片段，例如本文中公开的LCMV肽的片段(见例如由SEQ ID NO: 1_51的一种或多种编码的肽或肽片段，和/或SEQ IDNO: 52-58的一种或多种，或者SEQ ID NO: 52-58的一种或多种的片段/部分)。合适的片段可以包括在一种或多种LCMV病毒株或分离株之间保守的氨基酸区域。例如，合适的片段可以包括被鉴定在图5-7或SEQ ID NO: 1-58(包括例如由SEQ ID NO: 1_51的一个或多个编码的肽)中保守的区域。或者/并且，合适的片段可以包括与在一种或多种不同LCMV病毒株中的区域有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)的LCMV氨基酸内的区域。在一些情况下，合适的片段可以包括至少3个氨基酸(例如3-10个氨基酸)。或者/并且，合适的片段可以包括3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，I6，17，18，19，20，25，30，40，50，60，70，80，90，100或更多个氨基酸。在一些情况下，合适的片段可以包括抗原或表位。术语“抗原”指各种LCMV多肽或其片段(天然、重组或合成的)，其含有一个或多个与LCMV抗体结合的表位，并且来自于任何LCMV分离物/病毒株。而且，抗原可以是参考LCMV抗原分子(全长或其片段)与另一种不会干扰LCMV抗原反应性的抗原/蛋白/肽的融合蛋白。抗原可以是免疫原组合物的一部分，其是指一种样品(包括但不仅限于被感染细胞、全细胞裂解物`、`蛋白提取物)，可以是或者可以不是基本上纯化的(包含超过50%的内部存留样品)，或者可以是分离的(处于分离或离散的形式)。
[0142]术语NP抗原是指来自LCMV (例如包括任何LCMV病毒株和分离株)核衣壳蛋白的抗原。LCMV各种NP抗原的核苷酸或相应氨基酸序列是已知的(图2和5，SEQ ID NOSil-1l和31-40)。其他的序列已经保存在Genbank中，如在先前出版物中具体说明的(见下文)。可用于本发明的测定的一种代表性的免疫反应性NP抗原是一种来自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括数个表位，并且与该抗原结合的抗体与来自Armstrong病毒株的NP抗原具有交叉反应性。
[0143]术语“核糖核蛋白”或“RNP”是指被NP抗原覆盖的病毒基因组RNA节段(S和/或L)的复合体。这些RNP在LCMV感染期间在被感染细胞内形成，并也被释放到细胞外空间。
[0144]术语“GP抗原”是指来自LCMV (包括任何LCMV病毒株或分离株)糖蛋白的抗原。LCMV各种GP抗原的核苷酸或相应氨基酸序列是知的(见例如图3和6，SEQ ID N0S: 12-23和41-51)。其他序列已经保存在Genbank中，如在先前出版物中具体说明的(见下文)。可用于本发明的测定的一种代表性的免疫反应性NP抗原是一种来自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括数个表位，并且与该抗原结合的抗体与来自Armstrong病毒株的GP抗原交叉反应。
[0145]术语GPC抗原是GP抗原的一种前体、未成熟形式，并且以持续或异常感染为典型特征。它包含跨越GPC切割成GPl和GP2的切割区域(片段)的表位，该表位仅对GPC的特异识别有意义。LCMV各种GPC抗原的序列是已知的(见图3和6，SEQ ID N0S: 12-23和41-51)。
[0146]术语GPl抗原是包膜抗原的成熟的外部亚单位，包膜抗原是急性感染的典型特征。它包括GPl的C端区域(片段)的表位，该表位在GPC中是不暴露的。LCMV各种GPC抗原的序列是知的。
[0147]术语“ZP抗原”是指来自LCMV Z蛋白的抗原。LCMV的各种ZP抗原的核苷酸和相应氨基酸序列是知的(见图4和7，SEQ ID NOS:24-30和52-57)。其他序列已经保存在Genbank中，如在先前出版物中具体说明的(见下文)。可用于本发明的测定的一种代表性免疫反应ZP抗原是一种来自LCMV MX病毒株的融合蛋白。它包括数个表位,而且与该抗原结合的抗体同来自Armstrong病毒株的ZP抗原有交叉反应性。
[0148]术语“表位”是指抗原上的这样的位点:特异B细胞和/或T细胞应答于该位点，且该位点与生物样品中存在的LCMV抗体反应并刺激抗体产生。该术语可以和“抗原决定位点或抗原位点”互换使用。表位可以包含3-10个或更多个组织成独特的构象或线性形式的
氨基酸。
[0149]术语“免疫原性组合物”是指至少一种免疫原性多肽(例如NP，GP, ZP和/或核糖核蛋白(RNP))。
[0150]在一些实施方案中，LCMV的肽标志物可以用作诊断剂，例如用来检测生物样品中的针对LCMV的抗原。
[0151]抗原还可以用于产生诊断用的多克隆和单克隆抗体。多克隆抗体可以通过向哺乳动物，例如小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊、驼羊、马等，施用LCMV抗原来产生，LCMV抗原可以是分离的或者基本上纯化的LCMV抗原，或者可以是免疫原性组合物的一部分(即处于被感染细胞的形式)。可以从被免疫的抗原收集血清，并可以进一步纯化抗体。用于产生和处理多克隆抗体的技术是本领域已知的。
[0152]术语“抗体”使用其最广泛的意义，具体包括例如单克隆抗体(包括激动性抗体、拮抗性抗体和中和性抗体，去免疫化(de-1mmunized)抗体、鼠抗体、嵌合或人源化抗体),具有多表位特异性的抗体组合物，单链抗体，双抗体，三抗体、免疫偶联物和抗体片段。
[0153]这里所使用的术语“单克隆抗体”是指从基本上均质的抗体群体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可能存在少量的自然发生的突变体。单克隆抗体是高度特异的，靶向针对单个抗原位点。而且，与包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体不同，每个单克隆抗体指定针对抗原上的单个决定簇。除了其特异性之外，单克隆抗体的优点还在于，它们的合成不被其他抗体的污染。修饰语“单克隆”指示了抗体是从基本上均质的抗体群体获得的这一特征，而不是意味着要求抗体通过任何特殊的方法产生。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过杂交瘤(鼠或人)方法制备，其首先由Kohler et al.，Nature, 256:495 (1975)介绍，或者可以通过重组DNA方法(见例如美国专利N0.4，816，567)制备。“单克隆抗体”还可以使用例如Clackson etal., Nature, 352:624-628 (1991)和 Marks et al.，J.Mol.Biol.，222:581-597 (1991)介绍的技术从噬菌体展示文库分离。
[0154]“抗体片段”或“抗体结合片段”包括完整抗体的一部分，优选地包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括短于全长的抗体，Fab, Fab'，F(ab' )2，和Fv; 二价抗体；线性抗体；单链抗体分子；单链抗体；单结构域抗体分子；融合蛋白；重组蛋白和由抗体片段形成的多特异性抗体。
[0155]与兴趣抗原(例如LCMV抗原或标志物)“结合”的抗体是一种能够以足够的亲和性结合抗原的抗体，从而使抗体可用作治疗或诊断剂，靶定表达抗原的细胞。当抗体是结合LCMV抗原或标志物的抗体时，与其它抗原相比，它通常优先结合LCMV抗原或标志物，并且不包括偶然的结合，例如非特异性Fe接触，或者与和其它抗原共用的翻译后修饰结合，并可以是不与其它蛋白有显著交叉反应的抗体。用于检测与兴趣抗原结合的抗体的方法是本领域公知的，可以包括，但不仅限于，FACS、细胞ELISA和Western印迹等测定法。
[0156]“人源化”和/或“嵌合”形式的非人(例如鼠)免疫球蛋白是指含有特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(例如Fv，Fab, Fab’，F(ab’)2或抗体其它抗原结合序列)的抗体，其与原始抗体相比，可导致人抗小鼠抗体(HAMA)、人抗嵌合抗体(HACA)或人抗人抗体(HAHA)的响应降低，并且含有来自所述非人免疫球蛋白的、对于再现期望效果而言必需的必要部分(例如CDR、抗原结合区、可变区等)，同时保持与所述非人免疫球蛋白相当的结合特征。对于大多数部分，人源化抗体是如下的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体抗体互补决定区(CDR)的残基被来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠、家兔的CDR的残基代替，并具有期望的特异性、亲和性和能力。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人FR残基代替。而且，人源化抗体可以包含在受体抗体和导入的CDR或FR序列中均无发现的残基。进行这些修饰可以进一步调整和优化抗体性能。一般地，人源化抗体包括至少一个、典型地2个，可变结构域的基本上全部，其中与非人免疫球蛋白⑶R区相应的全部或基本上全部的CDR区和全部或基本上全部的FR残基是人免疫球蛋白共有序列。人源化抗体还最佳地包含至`少一部分免疫球蛋白恒定区(Fe)，通常是人免疫球蛋白。在一些情况下，本文中公开的抗体可以是人源化的。
[0157]在整个本专利申请中，杂交瘤细胞系以及由其产生的单克隆抗体用它们的国际名称，例如 M59, M87, M166,和 MJ3,或其保藏地名称 LMBP9216CB (M166)和 LMBP9217CB (MJ3)，来指称。
[0158]如这里所使用的，“免疫偶联物”是指与报告部分地化学或生物学地连接的任何分子，例如抗体或抗体片段。抗体可以在分子的任何位置与报告部分连接，只要它能够结合其靶标即可。
[0159]单克隆抗体可以在用如上所述的LCMV抗原或其片段免疫之后产生。被免疫动物含有正常B细胞的脾脏可以和骨髓瘤细胞融合，基本上通过Kohler和Milstein (1975)开发的程序，并且所产生的杂交瘤可以用各种免疫检测方法筛选以产生特定抗体。特定的单克隆抗体可以用杂交瘤培养基的形式中或者通过在蛋白A/G葡聚糖上通过亲和色谱加以纯化而获得。抗体分子片段，例如F(ab' ) 2，Fv和sFv分子可以用已知技术产生。或者，可以利用噬菌体展示系统在体外鉴定和扩增单克隆抗体分子群体和/或提高抗体的免疫性倉泛。[0160]适合于特异检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的组合物可以包括，但不仅限于，抗体和/或抗体片段。在一些情况下，术语“抗体”是指如下所述的分子，其片段(Fab' 2，Fab, Fv, sFv,微型抗体和任何其它功能片段)、其杂合体(嵌合)或双特异性变异体:其特异性结合目标抗原和/或表位。该术语同时包括从多克隆和单克隆制备物获得的抗体。在一些情况下，抗体或抗体片段可以是人源化的。
[0161]在一些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括)例如本文中公开一种或多种抗体(例如M87，M59，M166，和/或MJ3中的一种或多种)的重链和/或轻链可变区，或其部分。例如，组合物可以包括M87，M59，M166，和MJ3的重链和轻链可变区或其部分。或者，组合物可以包括M87，M59, M166,和MJ3的重链可变区或其部分，和M87，M59, M166,和MJ3的轻链可变区或其部分，其中该重链可变区和轻链可变区不是来自相同抗体。在一些情况下，组合物可以包括M87, M59, M166,和/或MJ3的一个或多个互补决定区(⑶R)(例如CDRl, CDR2和/或⑶R3的一个或多个)。例如，可以组合来自不同抗体的⑶R。
[0162]在一些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括)例如抗体M87的重链可变区(即SEQ ID N0:74)或与 SEQ ID NO: 74 具有至少 50% 同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或100%同一性)的氨基酸序列。在一些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括)例如抗体M87的重链可变区(即 SEQ ID N0:74)，其含有至少 I 个(例如 I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少于30，少于40，少于50，或少于100个)保守氨基酸替换，如下文所述。例如，在一 些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括)例如抗体M87的重链可变区(即SEQ IDN0:74)，其中相应于CDRl, CDR2和/或CDR3的区域可以含有至少I个(例如I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少于 30，少于 40，少于 50，或少于100个)保守氨基酸替换，而相应于CDR1，CDR2和/或CDR3的区域之外的区域(例如框架区(即FR1，FR2和/或FR3))与SEQ ID NO:74中相应的区域具有至少50%同一性(例如 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99%,或 100% 同一性)。在一些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括):M87重链可变区的⑶R3 (例如SEQ ID NO: 78)，和/或M87重链可变区的⑶R2 (例如SEQ ID N0:77)，和/或M87重链可变区的CDRl (例如SEQ ID NO:76)，其中CDR3、2和I的任一个可以任意地包含至少I个(例如I, 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，少于30，少于40，少于50，或少于100个)保守氨基酸替换。
[0163]在一些情况下，用于检测一种或多种LCMV肽或片段的组合物可以包括(例如可以由其构成，基本上由其构成，或可以包括)LMBP9216CB (M166)和/或LMBP9217CB (MJ3)。
[0164]如这里所使用的，表达语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可以互换使用，并且所有这些名称均包括后代。还应当理解，所有后代可能由于故意或不经意的突变而在DNA内容上是不精确相同。许多具有与最初的转化细胞所筛选的功能或生物活性相同的功能或生物活性的后代均包含在内。可以从上下文清楚地看出何处意图指定不同名称。
[0165]适合于特异检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的其它组合物可以包括抗原结合肽。这些肽特异性结合一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段。在一些情况下，这些肽可以包括本文所公开的抗体的互补决定区(⑶R)(例如⑶R1，⑶R2，⑶R3的一个或多个)。
[0166]在一些情况下，一种或多种抗体或其抗原结合片段可以通过插入一个或多个保守的氨基酸替换进行修饰。
[0167]“非必要”氨基酸残基是在多肽野生型序列中可以被改变的残基(不会消除或基本上改变其活性)。“必要”氨基酸残基是这样的残基，当相对于多肽的野生型序列改变该氨基酸时，会导致多肽活性消失或基本上消失 。
[0168]“保守氨基酸替换”是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替换。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已有定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、丝氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、
[0169]脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)，贝塔分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
[0170]在一些情况下，本文所用的术语“必要”氨基酸包括必要氨基酸的保守替换。一般地，“必要”氨基酸残基出现在α螺旋的相互作用面。
[0171]α螺旋的“相互作用面”包括与其它氨基酸残基相互作用的氨基酸残基。在这种情况下，相互作用面包括与LCMV相互作用的氨基酸。用于鉴定肽的相互作用面的方法是本领域已知的(见例如Broglia et al., Protein sc1., 14(10):2668-81, 2005;Hammond et al., J.Pharm.Sc1., 98 (I): 4589-603, 2009 ; Ng and Yang, J.Phys.Chem.B.，111(50):13886-93, 2007;和 Bird et al., PNAS USA, 197:14093，2010)。在一些实施方案中，本文公开的任何肽的氨基酸序列可以改变，只要相互作用表面的残基与SAH-p53-8的相同或者是其保守替换即可。
[0172]在一些情况下，适合于特异检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的组合物可以被修饰，从而包括例如氨基和/或羧基端标志物或基团(例如可检测基团)。基团的实例包括，但不仅限于，荧光基团(例如荧光探针(如荧光素或若丹明))、金属螯合基团、放射性同位素、或能够螯合反射性同位素的基团(例如与放射性同位素Re、In或Y螯合的巯基乙酰三甘氨酸或1，4，7，10-四氮杂环十二烷-N，N’，N”，N”’ -四乙酸(DOTA))，寻靶基团、生物素模块、tat蛋白、亲和标记、脂肪酸来源的酰基，和任何其它原本不存在于肽和/或任何其它肽(例如自然发生的肽)中，也不存在于在本文所公开方法中要使用的肽(例如LCMV肽或其片段，或用于检测LCMV肽或其片段的肽)中的可检测的基团。用于制备具有氨基和/或羧基端基团的肽的方法是常规的并且是本领域中已知的。术语“标签”是指一种能够检测的分子，例如放射性同位素、荧光染料、化学发光染料、发色团、金属离子、金属盐、酶、酶底物、酶辅助因子、酶抑制剂、适配子(生物素、亲和素、链亲和素、异羟洋地黄毒苷配基)等。
[0173]本领域的技术人员会容易地理解如何确定两个核酸或氨基酸的同一性。例如，可以在将两个序列比对从而使同一性处于最高水平后计算同一性。例如，核酸同一性可以用 Zuker, Science244:48-52 (1989);Jaeger et al., Proc.Natl.Acad.Sc1.USA86:7706-10 (1989) ; and Jaeger et al.,Methods Enzymo 1.183:281-306(1989)中公开的算法加以确定，本文通过提述并入这些参考文献中至少与核酸比对相关的材料。应当理解，任何这些方法通常都可使用，并且在一些情况下这些不同方法的结果可能会不同，但是本领域技术人员会理解，如果使用这些方法中的至少一种发现了所需水平的同一性，就可以称这些序列具有规定的同一性并且被申请所公开。
[0174]本发明的肽可以通过本领域技术人员公知的化学合成方法加以制备。见例如Fields 等，第三章，Synthetic Peptides: A User’s Guide, ed.Grant, ff.H.Freeman&C0., NewYork, N.Y., 1992, p.77。因此，肽可以在 Applied Biosystems 月太合成仪 Model430A 或 431上使用侧链被保护的氨基酸通过t-Boc或Fmoc化学保护a -NH2,使用自动化的Merrif ield固相合成技术加以合成。
[0175]本文所述的制造肽的一种方式是使用固相肽合成(SPPS)。C端氨基酸通过与接头分子形成酸不稳定的键附着在交联的聚苯乙烯树脂上。该树脂在用于合成的溶剂中不可溶，从而能够相对简单而快速地洗去多余的试剂和副产品。N端用Fmoc基团保护,该基团在酸中稳定，但是可以用碱除去。任何侧链功能基团均用碱稳定、酸不稳定的基团加以保护。
[0176]更长的肽可以通过使用自然化学连接(native chemical ligation)将单独的合成肽共同连接起来加以制备。或者，更长的合成肽可以通过公知的重组DNA技术加以合成。这些技术在公知的标准手册中有提供，并具有详细的操作规程。为了构建编码本发明肽的基因，将氨基酸序列逆翻译，从而获得编码氨基酸序列的核苷酸序列，优选地核苷酸序列具有适应待表达该基因的生物体的优化密码子。接着，制备合成基因，典型地通过合成编码该肽(以及，如果需要的话，任何调节元件)的寡核苷酸。将该合成基因插入到合适的克隆载体中并转染进入宿主细胞 。然后肽在适合于所选表达系统和宿主的合适条件下表达。通过标准方法对肽进行纯化和表征。
[0177]肽可以通过高通量的组合方式加以制备,例如可以从Advanced Chemtech获得的高通量多通道组合合成仪。
[0178]肽还可以在广泛的系统和宿主细胞中表达(例如重组表达)，包括昆虫、哺乳动物、细菌、病毒和酵母表达系统和细胞，所有这些都是本领域公知的。
[0179]许多可用于上述系统的合适宿主细胞也是已知的。例如，哺乳动物细胞系包括可以从细胞培养物中心获得的永生化细胞系，例如但不仅限于，CHO, HeLa, COS, MDCK等。
[0180]制备之后，可以用常规方法对肽进行测定，例如确定其序列、结合亲和力和稳定性(体外和体内)。
[0181]在一些实施方案中，本文中公开的一种或多种组合物可以安置在固体支持物上。术语“固体支持物”是指可以附着大分子例如蛋白、多肽、肽、多核苷酸等的固体表面，包括但不仅限于，微孔板孔、sepharose/琼脂糖基质、磁珠、玻璃片、尼龙、聚丙烯酰胺、硝酸纤维素膜、二氧化硅板等。而且，固体支持物的代表可以是培养物或组织样品中的被感染细胞，其含有暴露在细胞表面或存在于细胞质中的LCMV抗原。
[0182]术语“免疫复合体”是指在测定环境中通过抗体与抗原结合形成的分子组合物。它还指生物样品中天然出现的含有病毒核糖核蛋白和免疫球蛋白的多分子组合物。
[0183]诊断方法
[0184]本公开还描述了用于检测样品中LCMV的方法，例如使用一种或多种本文公开的用于检测LCMV的组合物(例如一种或多种探针或引物，和/或一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段，和/或一种或多种用于检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段)检测样品中LCMV的方法。
[0185]针对LCMV抗原/表位的抗体可以用于检测生物样品中LCMV蛋白或核糖核蛋白的存在，例如使用不同的免疫测定方法或者与分子方法组合的免疫测定方法。免疫测定可以使用一种或多种抗体，且操作规程可以具有不同的形式，包括直接反应、三明治式、竞争、免疫沉淀、免疫印迹等。它们还可以和扩增程序组合呈免疫-PCR形式，其中扩增模板是病毒RNA或与抗体/抗体或检测物连接的寡核苷酸。这些程序是本领域已知的。
[0186]诊断测定可以检测病毒抗原或抗病毒抗体。测定可以包括免疫沉淀(IP)、免疫印迹(IB)、IP和IB的组合、酶标志物的免疫测定、生物素/亲和素型测定、PCR、免疫-PCR等。检测一般包括显示标记物，例如荧光、化学发光、放射性、酶标志物或染料分子，或者用于扩增产生带标记的产物的寡核苷酸。
[0187]测定一般地涉及将液相中的未结合抗体或抗原与抗原-抗体复合体所结合的固体支持物(有或者没有捕捉物)分离。然后，用与标记物相互作用或偶联的检测物检测抗原-抗体复合体。
[0188]典型地，首先令固体支持物与捕捉物反应。然后通过冲洗除去任何未固定的组分，然后在合适的条件下使固体支持物结合的组分与生物样品接触。在清洗除去任何未结合材料之后，可以在合适的结合条件下添加第二结合模块，即检测物。然后可以使用本领域公知的技术检测检测物的存在。或者，检测物可以和带标记的竞争分子同时添加，竞争的程度可以揭示样品中存在的 检测物的量。
[0189]该测定可以进行几种不同的变化形式，如图8和9所示。图8显示了采用LCMV抗原或抗体的免疫检测试验实例的组合物。
[0190]在A系列的测试中，单独的病毒抗原或它们的混合物作为捕捉物，与来自生物样品的抗-LCMV抗体结合，然后用各种检测物或其组合进行检测。在Al变化形式中，检测物是直接偶联标记物的蛋白A/G。在A2变化形式中，检测物是直接偶联标记物的第二抗人(或抗小鼠或其它动物物种特异性的)IgG或IgM。在A3变化形式中，检测物抗体与生物素偶联，生物素进一步结合亲和素/链亲和素，然后用标记物偶联的生物素加以显示。在A4变化形式中，第二抗体与寡核苷酸连接，寡核苷酸可以在带标记的三核苷酸存在下通过相应的引物进行扩增。在A5变化形式中，第二抗体与生物素偶联，其然后用亲和素/链亲和素和与寡核苷酸连接的生物素进行反应，该寡核苷酸能够在带标记的三核苷酸存在下通过相应的引物进行扩增。
[0191]在B系列的测定中，特异针对NP，GP (例如GPC，GPl)和/或ZP的抗体附着在固相上，并充当结合来自生物样品的LCMV抗原的捕获物，然后用非竞争性抗体或抗体/缔合的检测物加以检测。在BI变化形式中，检测物是与标记物直接偶联的LCMV抗原特异性抗体。在B2变化形式中，检测物是与标记物直接偶联的抗人(或抗小鼠或其它动物物种特异性的)IgG或IgM。在B3变化形式中，检测物抗体与生物素偶联，生物素进一步结合亲和素/链亲和素，然后用标记物偶联的生物素加以显示。在B4变化形式中，第二抗体与寡核苷酸连接，该寡核苷酸可以在带标记的三核苷酸存在下通过相应的引物进行扩增。在B5变化形式中，第二抗体与生物素偶联，其然后用亲和素/链亲和素和与寡核苷酸连接的生物素进行反应，该寡核苷酸能够在带标记的三核苷酸存在下通过相应的引物进行扩增。[0192]在一些实施方案中，所述方法包括选择受试者(术语“受试者”在整个说明书中用于描述动物，包括人或非人类。人和兽医应用均被涵盖。该术语可以包括例如哺乳动物，例如人、其它灵长动物、猪、啮齿动物例如小鼠和大鼠、家兔、豚鼠、仓鼠、牛、马、猫、狗、绵羊和山羊)。例如，可以选择具有LCMV感染危险的受试者或被怀疑具有LCMV的受试者。或者/并且，可以选择具有会导致受试者更易于被LCMV造成损害的病症或疾病的受试者。这些受试者可以包括计划怀孕或已经怀孕的受试者，免疫受损的受试者，移植接受者，和具有癌症发生危险或患有癌症的受试者。在一些实施方案中，如果受试者患有已知会在受试者体内产生缺氧的病症，则选择该受试者。
[0193]在一些实施方案中，在筛选之后，可从受试者获得样品。然后可以使该样品与一种或多种用于检测本文中公开的LCMV的组合物(例如一种或多种探针或引物，和/或一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段，和/或一种或多种用于检测一种或多种LCMV肽或LCMV肽片段的组合物(例如一种或多种抗体或抗体片段))接触。在一些情况下，方法可以包括如果在受试者体内检测到LCMV，则治疗LCMV感染或推荐受试者进行LCMV感染治疗。
[0194]该方法还可包括在治疗期间和之后对受试者进行监测或评估，以确定治疗的效力，并且如果必要，调整治疗以提高治疗的效力。
[0195]试剂盒
[0196]本公开还描述了包含一种或多种用于检测本文所公开LCMV的组合物的试剂盒。试剂盒还可以包括与组合物和使用组合物的方法有关的信息材料。信息材料可以是描述性的、指导性的、销售或者其它与这里所述组合物和方法有关的材料。
[0197]试剂盒的信息材料并不受其形式的限制。在许多情况下，信息材料(例如使用说明书)被提供为印刷材料，例如印刷的文本、图片和/或照片，例如标签或印刷册页。然而，信息材料也可以用其它格式提供，例如盲文、计算机可读材料、视频记录或声音记录。当然，信息材料还可以用任何组合形 式提供。
[0198]除了化合物之外，试剂盒的组合物可以包括其它组分，例如溶剂或缓冲剂、稳定化剂、防腐剂、和/或用于治疗本文中所述病症或疾病的第二药剂。或者，试剂盒中可以包含其它成分，但是处于与化合物不同的组合物或容器内。在这些实施方案中，试剂盒可以包括用于混合试剂和其它成分的使用说明，或者用于和其它成分一起使用一种或多种化合物的使用说明。
[0199]本文中公开的序列是公共可得的，例如在美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站上(见ncb1.nlm.nih.gov),和在文献中，如下:
[0200]LCMV 病毒株MX GPC 基因，NCBI 登录号 EU195888 (EU195888.1)和 Tomaskova, J etal., Virus Genes, 37:31-38(2008);
[0201]LCMV 病毒株 MX NP 基因，NCBI 登录号 Y16308 (Y16308.1)和 Reiserova, L.etal.，Virology257:73-83(1999);
[0202]LCMV 病毒株 MX Z 基因，NCBI 登录号 AJ131281 (AJ131281.1)和 Gibadulinova, A.et al., Acta Virol.，42:369-374(1998);
[0203]LCMV 病毒株 Armstrong53b - S 节段，NCBI 登录 M20869 (M20869.1)和 Salvato, M.et al.,Virology, 164:517-522(1988);
[0204]LCMV 病毒株 Armstrong53b - LS 节段，NCBI 登录 AY847351 (AY847351.1)和Grande-Perez, A.et al., J.Virol., 79:10451-10459 (2005);
[0205]LCMV 病毒株 CH-5692 - S 节段，NCBI 登录号 AF325214 (AF325214.1);
[0206]LCMV 病毒株 CH-5692 - L 节段，NCBI 登录 DQ868484 (DQ868484.1);
[0207]LCMV 病毒株 CH-5871-S 节段，NCBI 登录号 AF325215 (AF325215.1)和 Asper, M.etal.,Virology, 284:203-213(2001);
[0208]LCMV 病毒株 Traub - S 节段，NCBI 登录号 DQ868487 (DQ868487.1);
[0209]LCMV 病毒株 Traub - L 节段，NCBI 登录号 DQ868488 (DQ868488.1)和 Emonet, S.etal., Genetic comparisons and evolution of6LCMV strains;
[0210]LCMV 病毒株 LE GPC 基因，NCBI 登录号 EF164923 (EF164923.1)和 Meritet, J.F.eta1., Human Fetal Lymphocytic Choriomeningitis Virus Infection with a New GenomicVariant;
[0211]LCMV 病毒株 Ml - S 节段，NCBI 登录号 AB261991 (AB261991.1);
[0212]LCMV 病毒株 M2- S 节段，NCBI 登录号 AB261990 (AB261990.1)和 Ike, F.etal.，Comp.Med.57:272-281 (2007);
[0213]LCMV 分离物 Marseille#12 - S 节段，NCBI 登录号 DQ286931 (DQ286931.1);
[0214]LCMV 分离物 MarseiIle#12 _ L 节段，NCBI 登录号 DQ286932 (DQ286932.1)和Emonet, S.et al., Emerging Infect.Dis., 13:472-475 (2007);
[0215]LCMV 病毒株 WE- S 节`段，NCBI 登录号 M22138 (M22138.1)和 Romanowski, V.etal.,Virus Res.,3:101-114(1985);
[0216]LCMV 病毒株 WE-S 节段，NCBI 登录号 AF004519 (AF004519.1)和 Djavani, M.etal.,Virus Genes, 17:151-155(1998);
[0217]LCMV 病毒株 Bulgaria - S 节段，NCBI 登录号 GQ862982 (GQ862982.1);
[0218]LCMV 病毒株 Bulgaria-S 节段，NCBI 登录号 GQ862981 (GQ862981.1)和Palacios, G.et al., Genetic diversity of Lymphocytic choriomeningitis viruses;
[0219]LCMV 病毒株 Y-S 节段，NCBI 登录号 DQl 18959 (DQl 18959.1)和 Compton, S.R., Lymphocytic choriomeningitis virus 病毒株 Y;和
[0220]NCBI 登录号 FJ607019-FJ607038, 13-JUL-2010，Albarino, C.G.et al.，EmergingInfect.Dis., 16:1093-1100(2010)。
[0221]实施例
[0222]本发明进一步在下列实施例中进行介绍，其不会限制权利要求中所述的本发明的范围。
[0223]实施例1:在多种LCMV病毒株/分离株之间存在保守的序列区域
[0224]新近对从多个地理和时间来源收集的29个LCMV病毒株的基因组分析显示，这些病毒是多样性的。存在数个截然不同的世系，但是它们与分离的时间和地点几乎没有关联(Albarino et al, 2010) 0所有已知LCMV分离物的S和L节段序列分布在3个(L节段)或4个(S节段)不同的遗传群体或世系中。在S节段世系之间观察到了最高达25%的核苷酸分歧，在L节段世系之间最高有28%的分歧。这种核苷酸分歧导致Z，L, GPC和NP蛋白中的分别为18%, 13%, 10%,和6%的分歧(Albarino et al, 2010)。然而，在不同病毒株/分尚株之间存在具有可观的序列同一性的区域(见图2-7)，并且衍生的抗原与LCMV特异性抗体显示交叉反应性。
[0225]这些观察支持多种LCMV病毒株和/或分离株可以用合适的分子和免疫检测方法加以检测。
[0226]实施例2:缺氧从持续感染中重新激活LCMV
[0227]被LCMV MX株持续感染的HeLa细胞(HeLa-MX)在正常氧(21%02)或缺氧(2%02)条件下温育48h。将另一 HeLa-MX细胞群体也在正常氧条件下用ImM DMOG (一种缺氧模拟剂)处理24小时。
[0228]RT-PCR
[0229]用InstaPure试剂根据制造商的使用说明提取总细胞RNA。用M-MuLV逆转录酶使用随机七聚体引物实施逆转录。在StepOneTM实时PCR系统(Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA.)上用POWER SYBR? Green PCR主混合物和如下的基因特异性引物进行定
量实时PCR，来分析病毒基因的表达水平:
[0230]NP (246 碱基对(bp) PCR 产物):
[0231]正向:5，--GATCAGAAACAGTTCAAACAGGACT-3，(SEQIDNO:58)[0232]反向:5’ --GTCCCACACTTTGTCTTCATACTCT-3，(SEQIDNO:59)[0233]GP (25 Ibp PCR 产物):[0234]正向:5，--AACCAGTGCAGAACTTTTAGAGGTA-3’(SEQIDNO:60)[0235]反向:5’ --GCAAGTCTTCTAGTGAGGAACTTTG-3，(SEQIDN0:61)[0236]ZP (272bp PC·R 产物):[0237]正向:5，--CCTGTGAGAGTACAGAGACAAACCT-3’(SEQIDNO:62)[0238]反向:5’ --GATATCTTCAGCTTGGTTGGTAATG-3’(SEQIDNO:63)
[0239]β -肌动蛋白(236bp PCR 产物):
[0240]正向:5，-CCAACCGCGAGAAGATGA-3’(SEQ ID NO:64)
[0241]反向:5，-GATCTTCATGAGGTAGTCAGT-3，(SEQID NO:65)
[0242]对于每个基因，使用β -肌动蛋白作为内源对照，通过与来自正常氧对照的数值进行比较确定倍数诱导。
[0243]如图1OA和IOB所示，如RT-PCR所评估地，与正常氧相比,缺氧与DMOG相似地增加了编码所有的受测LCMV蛋白(即NP, ZP和GP)的mRNA的表达。对照(β _肌动蛋白)没有观察到改变。
[0244]为了证明缺氧在转录水平上影响病毒基因，使用GeneRacer方法进行RNA连接酶介导的快速5’ cDNA末端扩增(RLM-RACE)，其允许选择性扩增5’加帽的转录本，并清除未加帽的基因组/反基因组LCMV RNA模板。
[0245]MX LCMV的5 ’加帽转录本的选择性扩增用GeneRacerTM试剂盒根据制造商(Invitrogen, Life Technologies)的使用说明来进行。对从正常氧和缺氧HeLa-ΜΧ细胞分离的RNA进行的RLM-RACE中采用的LCMV-MX基因特异性引物如下:
[0246]NP 基因
[0247]5’ RACE 反向引物:CAAGGTCGGCAGCGAGAGACATCA(SEQ ID NO:66)
[0248]5’ RACE 巢式反向引物:AGAAGGCTAGTTGCGTCCTTGATG(SEQ ID NO:67)
[0249]GP 基因[0250]5’ RACE 反向引物:GGCTGAACATGCATTGGGCATTGT(SEQ ID NO:68)
[0251]5’ RACE 巢式反向引物:TAGGAGAAGGAAGCTGACCAATGC(SEQ ID NO:69)
[0252]L 基因
[0253]5’ RACE 反向引物:TCCTGGACACACAACTCCGGACTCTA(SEQ ID NO:70)
[0254]5’ RACE 巢式反向引物:ACAGCCACTTTTGTCTGCACTGTC(SEQ ID N0:71)
[0255]Z 基因
[0256]5’ RACE 反向引物:CTTCGTAGGGAGGTGGTGGGCTTG(SEQ ID NO:72)
[0257]5’ RACE 巢式反向引物:AGTTCAGTGGACCGAGATAGGTGGT (SEQ ID NO: 73)[0258]β -肌动蛋白用作内部标准和RLM质量控制，使用试剂盒中附带的引物。所得的PCR片段在1.5%琼脂糖凝胶上分离，并通过测序和用独立的基因特异性引物重扩增来检验其特异性。相应于各个PCR产物的条带强度用Syngene的GeneTools软件进行评估。基因特异性PCR产物的量半定量地表示为每个LCMV特异性条带的强度与相应β -肌动蛋白内部标准的强度的比值。试剂盒中附带的市售HeLa总RNA用于β _肌动蛋白扩增，作为CIP和TAP酶活性的对照。
[0259]如图1OD所示，对从缺氧(2%02)和正常氧HeLa-ΜΧ细胞分离的总RNA实施的RLM-RACE半定量评估结果，与上述RT PCR数据一致(见图10Α)，提示缺氧影响病毒转录。
[0260]免疫印迹
[0261]将I百万个HeLa-MX种植到培养皿中，使之贴壁过夜，然后在正常氧和缺氧条件下温育 48h。将细胞在裂解缓冲液(50mM Tris, ρΗ7.5，150mMNaCl, l%Triton X-100, 0.1% 脱氧胆酸钠和Ix完全蛋白酶抑制剂鸡尾酒[Roche，曼海姆，德国]，溶于PBS中)中破裂，用BCA测定系统(Pierce, Rockford, IL, USA)根据制造商的使用说明测定总蛋白浓度。将总蛋白提取物(100 μ g/泳道)在还原条件下通过SDS/PAGE进行分离，印迹到PVDF膜(ImmobilonTM, Millipore, Billerica, MA, USA)上，并通过使用针对NP (小鼠单克隆抗体M59)，Z蛋白(小鼠单克隆抗体MJ3)，GPl (抗-肽多克隆抗体)，HIF-1alpha或alpha-肌动蛋白的特异抗体，通过与辣根过氧化物酶偶联的合适的第二抗体加以检测。所有的免疫印迹用ECL检测系统进行显影。
[0262]如图1OC所示，与正常氧条件相比，缺氧提高了所有受测的LCMV蛋白的表达水平。对照(肌动蛋白)没有观察到变化。
[0263]实施例3:被缺氧重新激活的LCMV是感染性的
[0264]使用来自在正常氧和缺氧条件下培养了 48h的HeLa-MX的过滤培养基感染未被感染的HeLa细胞。然后在正常氧条件下培养这些细胞，传代，然后评估病毒复制。
[0265]通过RT-PCR方法确认了来自正常氧(NO)和缺氧(HY)条件下培养的HeLa-MX细胞的培养基中LCMV基因组的存在(见图11A)。此外，通过RT-PCR分析在最先五代和第十代中跟踪了用指定培养基感染的HeLa群体中感染的扩散(见图11B)。还通过在20x放大倍数下通过免疫荧光检测受体细胞内的病毒核糖核蛋白来监测感染的进展(见图11C)。实验重复2次，每次均显示相似的结果。如图11A-11C所示，缺氧可提高LCMV的感染性。
[0266]实施例2和3显示的数据证明，缺氧能够提高培养中病毒NP，Z和GP(包括GPl的出现)基因和蛋白的表达(实施例1)，并能够触发感染性病毒颗粒的形成(实施例2)。
[0267]这些数据支持了用缺氧病毒基因、抗原、针对这些抗原的抗体和其组合诊断性检测具有缺氧危险的受:试者体内的LCMV的原理。
[0268]实施例4:特异性结合LCMV NP的抗体的产生
[0269]小鼠单克隆抗体M59、M166和M87特异针对LCMV NP。这些抗体用杂交瘤技术(Kohler and Milsteinl975)加以制备。
[0270]BALB/c小鼠用三剂5xl06个HeLa-MX细胞免疫，然后将其脾细胞与NS-O骨髓瘤细胞融合。在含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的DMEM-HAT培养基中筛选杂交瘤，然后使用HeLa和HeLa/MX细胞的细胞提取物作为抗原，通过差异ELISA筛选对NP具有特异反应性的杂交瘤。阳性杂交瘤培养物通过有限稀释法进行克隆，扩展和用于单抗的生产。
[0271]所有M59，M166和M87均结合来自LCMV MX的NP，并与其它LCMV病毒株的NP具有交叉反应。
[0272]实施例4A:M166的保藏
[0273]将表达小鼠单克隆抗体M166的杂交瘤细胞系于2011年12月2日保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM) (Universiteit Gent, VakgroepMoleculaire Biolgie-Plasmidicollectie (BCCM?/LMBP))，保藏号为 LMBP9216CB。
[0274]实施例4B:M87可变区序列的表征
[0275]确定了 M87重链的氨基酸序列，如下所示，同时示于图12A。从I百万个M87细胞中分离RNA，并使用随机七聚体引物进行反转录。从所得的cDNA扩增重链可变区，其中使用设计成与信号肽/前导序列互补的简并正向引物(见图12)和与恒定域CHl区互补的反向引物(见图12)。扩增使用高保真聚合酶，通过电泳分离预期大小(大约400bp)的PCR产物，并从凝胶将其分离 。将线性PCR扩增子连接到pjetl.2载体内，然后转化感受态大肠杆菌。对所得的转化细胞进行筛选，并通过限制性酶切和测序对选定的菌落进行核实。M87重链可变区的序列被确定如下:
[0276]mdsrlnlvflvlilkgvqcdvqlvesggglvqpggsrklscaasgftfssfgmhwvrqapekglewvay issgsstlhyadtvkgrftisrdnpkntlflqmklpslcyglIgsrnlshrIlsqndtpirlsigpwklgi(SEQID NO:74)
[0277]在M87 重链可变区(SEQ ID NO: 74)中，mdsrInlvflvlilkgvqc (SEQ ID NO: 75)是信号妝序列；gftfssfgmhwv (SEQ ID NO:76)是CDRl ；issgsstlhyadtvkgrft (SEQ ID NO: 77)是 CDR2 ；hrllsqndtpirlsigp(SEQ ID NO:78)是 CDR3。图 12B-12C 提供了 SEQ ID NO:74)的带注释的变化形式。
[0278]实施例5:特异性结合LCMV GPl的抗体的产生
[0279]如下产生了针对LCMV MX GPl的多克隆抗体。使用数种可用的程序利用GPC LCMVMX的完整序列鉴定了潜在的B细胞表位。选择定位于GPl区域内的肽RSGWGWAGSDGKTT (SEQID NO:41的aa205-218) (SEQ ID NO:89)用于产生GPl特异的多克隆抗体。亲和纯化的兔多克隆抗体通过免疫沉淀和Western印迹加以测试。
[0280]实施例6:特异性结合LCMV ZP的抗体的产生
[0281]小鼠单克隆抗体MJ3特异性结合LCMV ZP0抗体用杂交瘤技术(Kohler andMilstein,上文)产生。简而言之，用两个剂量的5xl06HeLa-MX细胞免疫BALB/c小鼠，并用100 μ g与谷胱甘肽Sepharose4B结合的GST-Z蛋白进行强化免疫(boosted)。3天后，进行脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞的融合。杂交瘤在DMEM-HAT培养基中进行筛选，并对于杂交瘤产生的抗体，通过ELISA和免疫印迹筛选它们针对GST-Z中(相对于GST)和HeLa-MX中(相对于未感染的HeLa细胞)对Z蛋白的特异反应性。杂交瘤培养物(MJ3)通过有限稀释进行亚克隆，扩增，并用于单抗的产生。
[0282]用不同的检测方法均显示单抗MJ3与Z蛋白反应。
[0283]实施例6A:MJ3的保藏
[0284]将表达小鼠单克隆抗体MJ3的杂交瘤细胞系于2011年12月2日保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM) (Universiteit Gent, VakgroepMoleculaire Biolgie-Plasmidicollectie (BCCM?/LMBP))，保藏号为 LMBP9217CB。
[0285]实施例7:在人类受试者中检测抗LCMV NP抗体
[0286]从(i)发生了自发流产但没有诊断出原因的妇女；(ii)具有足月妊娠的妇女；和(iii)患有肾细胞癌(RCC)肿瘤的癌症患者获得血清样品。通过免疫沉淀并随后用NP特异性单克隆抗体进行免疫印迹来分析人血清中的抗-LCMV抗体。 [0287]本实施例中使用的方法非常灵敏，并能够检测在急性和慢性/持续感染二者中产生的NP特异性抗体。简而言之，将蛋白G-S印haroSe(50%浆液)用PBS清洗，并与来自HeLa-MX细胞的全细胞裂解物混合，以预清除非特异性结合蛋白。向100 μ I经过预清除的细胞提取物添加含有10%FCS的溶于190 μ I PBS中的10 μ I人血清。然后在4°C过夜以形成免疫复合体。所得的免疫复合体通过添加30 μ I经过清洗的蛋白G-Sepharose浆液，在4°C放置I小时来沉淀。然后将珠子在PBS中清洗5次，进行SDS-PAGE并转移到聚偏氟乙烯膜上。膜用与辣根过氧化物酶偶联的纯化单抗进行探测。再经过一个清洗步骤后，用ECL检测系统使免疫印迹可视化。
[0288]如表1A-1B所示，NP抗体在流产妇女中的血清阳性率(seroprevalence)比对照闻 19.4%ο
[0289]表1A:在经历了自发流产的人类女性受试者中检测的抗-LCMV NP抗体
[0290]
经流产妇女未流产妇女人数%人数 ％阳性血清3475,618 56,2阴性血清1124,414 43,8总计4510032 100
[0291]检测到的抗体亦示于图13中的免疫印迹。
[0292]如表4所示，在患有RCC肿瘤的患者中也观察到了非常高的NP抗体血清阳性率。
[0293]表1B:在患有RCC肿瘤的受试者中检测的抗-LCMV NP抗体
[0294]癌症患者人数 %阳性血清2589,3阴性血清310,7总计28100
[0295]实施例7B:通过串联质谱在人血清中检测NP特异性抗体
[0296]对一份通过免疫沉淀和随后用NP特异性单克隆抗体进行免疫印迹显示对NP阳性的人血清进行免疫沉淀，如实施例7所述。清洗之后，免疫复合体用柠檬酸盐缓冲液(pH3)进行洗脱。通过添加IM Tris pH8.5对洗脱物的最终pH进行调节。随后，对含有免疫复合体的洗脱物进行串联质谱。简而言之，将样品还原(IOmM 二硫苏糖醇)、烷基化(55mM碘乙酰胺)，并用含有20 μ g/ml胰蛋白酶(Promega, Madison, WI)的50mM碳酸氢铵在37°C消化过夜。将所得的肽转移到微孔板并冷冻干燥。将提取的肽混合物溶解在20 μ I添加有0.1%甲酸的2%乙腈水溶液中，如前人所述(Henrychova et al., 2008)通过nanoAcquity UPLC系统(Waters, Milford, MA)进行分离。在分离的全时间内以数据依赖的方式进行数据获取，最高同时收集 3 个 MS/MS 事件。数据用 ProteinLynx Global Server v.2.4 (Waters)进行处理，其提供背景消减(5阶多项式和阈值35%)、平滑(Savitzky Golay,两次，对三个通道)和质心定位(centroiding)(顶，80%,半高为4的最小峰宽)。将所得的数据按照如下的标准在UniPix)t_LCMV数据库中进行检索:固定的Cys氨甲酰甲基化，可变的Met氧化，具有I个缺失切割的胰蛋白酶消化片段，肽质量容忍度50ppm，和片段质量容忍度0.05Dao通过鉴定来自相同系列的三个或更多个连续片段离子对结果进行验证。与理论序列具有至少2个匹配肽的蛋白指派视为阳性鉴定。
[0297]如表2所示，在所分析的样品中鉴定出了 LCMV NP。
[0298]表2:通过UPLC-MS鉴定免疫复合体中的NP
[0299]`
样品登录描述mW (Da)Pl (pH)PLGS Score肽MSH3C3WN3核蛋白OS淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒623998,661465,51042.processingQ9YPMI糖蛋白I片段OS淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒株WE155358,4294282,26IC3WN3核蛋白OS淋巴细胞性脉絡丛脑膜炎病毒623998,661466,5513MSE5Q86867S RNA产物蛋白片段OS淋巴细抱性脉络丛脑膜炎病毒15966,2774250,47I
[0300] 该结果清晰地证明，被测试的人血清中含有NP特异性抗体。
[0301 ] 实施例8:在来自人RCC受试者的组织中免疫检测LCMV抗原
[0302] 通过免疫化学检测RCC样品中的LCMV抗原。简而言之，将切下的组织在4%中性缓冲的福尔马林中固定，并根据标准的组织学程序包埋在石蜡中。将4μπι切片置于包被有多聚赖氨酸的载玻片上，脱腊，并复水。首先将载玻片在祀修复溶液(target retrievalsolution)中(Pascal 压力室，DakoCytomation, Carpinteria, CA)在 125°C 5min 进行组织预处理程序。免疫染色程序剩余部分使用Dako Cytomation EnVision (r) +系统-HRP (DAB)根据制造商的使用说明来进行:a)过氧化物酶和蛋白封闭海次10min);b)用NP特异的第一抗体M59 (未稀释的杂交瘤培养基)或PBS (阴性对照)孵育Ih ;c)用过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠抗体孵育30min,抗体在抗体稀释剂(DakoCytomation)中1:1000稀释。染色用DAB溶液处理Imin进行可视化，以3，3’ - 二氨基联苯胺作为发色底物。在步骤a后用
0.l%Tween-20的PBS清洗载玻片lOmin，在步骤b和c后进行2次IOmin清洗，在用DAB可视化后在蒸馏水中清洗三次。所有的孵育和清洗步骤均在室温下进行。最后，用Mayer氏苏木精对切片进行复染，清洗5min,并固定在DePeX (Serva, Heidelberg, Germany)中。染色的切片在Leica DM4500B显微镜下进行检查，并用Leica DFC480相机照相。
[0303]如图14A-B所示，在来自RCC受试者的组织中检测到了 LCMV抗原。
[0304]此外，通过免疫沉淀和随后用NP特异性抗体M87进行免疫印迹在RCC样品中检测到了 LCMV抗原。简而言之，IOOmg冷冻组织样品在含有蛋白酶抑制剂(Roche AppliedScience, Mannheim, Germany)的冰冷的裂解缓冲液(l%Triton X-100; 150mM NaCl; 50mMTris, pH7.5;0.5%Nonidet P-40; 50mM NaF)中匀浆。通过 4°C 12，OOOg 离心 15min 除去不溶的材料。将单抗M87 (I, 5ml经培养的培养基)与30 μ 150%蛋白G-S印harose PBS悬液在RT下结合2小时。组织蛋白提取物(200 μ I)用20 μ 150%蛋白G-S印harose悬浮物预清除，然后添加到已结合的单抗。然后4°C过夜令免疫复合体形成。随后，将珠子在PBS中清洗6次，进行SDS-PAGE并转 移到聚偏氟乙烯膜上。膜用偶联辣根过氧化物酶的纯化单抗M87进行探测。再进行一个清洗步骤后，用ECL检测系统将免疫印迹可视化。
[0305]如图14C所示，使用单抗M87在来自RCC受试者的组织中检测到了 LCMV NP。
[0306]实施例9:NP特异性单克隆抗体的分析
[0307]通过杂交瘤技术(Kohler and Milsteinl975)制备了特异针对NP LCMV的小鼠单克隆抗体M59，M166，和M87。简而言之，用三个剂量的5xl06HeLa_MX细胞免疫BALB/c小鼠，将其脾细胞与NS-O骨髓瘤细胞融合。杂交瘤在含有次黄嘌呤、氨甲喋呤和胸苷的DMEM-HAT培养基中进行筛选，并使用HeLa和HeLa/MX细胞的细胞提取物作为抗原通过差异ELISA筛选对NP具有特异反应性的杂交瘤。阳性杂交瘤培养物通过有限稀释进行克隆，扩增，并用于产生单克隆抗体。每个单克隆抗体M59，M166，和M87均显示与其它LCMV病毒株的NP交叉反应。
[0308]使用亲和纯化的兔抗小鼠IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG3、IgM和IgA抗体(小鼠单克隆抗体分型试剂，Sigma),根据制造商的使用说明通过ELISA确定单抗同种型。发现M59和M166单抗是IgG2a同种型，而M87单抗是IgGl同种型。
[0309]进一步在不同的免疫检测方法中对抗体进行测试。发现M59在ELISA、免疫沉淀和免疫组化中与NP反应；发现M166在ELISA、IFA和免疫沉淀中与NP反应；并发现M87在ELISA、免疫沉淀、IFA和免疫印迹中与NP结合。这些数据提示，抗体识别NP分子的不同表位,M59和M166定向于构象表位,M87结合线性表位。通过竞争结合试验证实了这些抗体的不同表位特异性。[0310]简而言之，首先通过在蛋白A/GSepharose上进行亲和色谱来纯化单抗，用NHS-LC-生物素(Pierce)根据制造商的使用说明对单抗进行标记。将来自HeLa-MX细胞的提取物吸附在微孔板的孔上，浓度相当于被标记的单抗最大结合的50%。清洗经包被的平板，用含10%FCS的PBS饱和。添加5倍系列稀释于30 μ I中的纯化单抗和恒定量的30 μ I生物素化单抗，并在4°C孵育过夜。清洗平板，并使用过氧化物酶标记的链亲和素(Pierce)作为检测剂。
[0311]结果如图15A和15B所示。这些是显示M87和M59单抗之间竞争结合的检查结果的图。使生物素标记的纯化抗体(*)在递增量的未标记的竞争抗体的存在下进行结合。将在未标记的竞争者的存在下标记的抗体的结合量表示为不存在竞争者时结合量的百分比。稀释度O相当于10 μ g/孔的未标记的竞争抗体。结果显示仅存在同源竞争，而没有观察到对标记的竞争者结合的异源干扰，提示这些单抗结合于非重叠的表位。
[0312]实施例10:病毒对缺氧的响应:LCMV沙粒病毒作为范例
[0313]被病毒感染细胞的生理环境(context)可能显著影响病毒后代的增殖与扩散。主要在持续感染期间，在此期间病毒强烈依赖宿主细胞并且通常不会干扰其维持生命所必需的功能，微环境胁迫(例如缺氧)可能打断病毒-宿主的紧密关系并提高病毒的致病(pathogenesis)。越来越多的证据提示,受HIF转录因子调控的缺氧诱导的分子响应会调变如下所述的病毒的基因表达:经历DNA阶段、在其启动子中含有HRE、并在细胞核中复制。我们首次显示，缺氧还会影响持续细胞质RNA病毒感染的结果。作为模型，我们使用淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)，其能够在不同细胞类型中持续存在而不会干扰这些细胞完整性，并其导致的感染大多不明显。它因此被认为是无害的，尽管LCMV相关的流产和移植接受者的致死性LCMV感染警示它可能是有危险性的。LCMV复制物的MX病毒株在人HeLa细胞中以持续的模式复制，并在没有细胞外感染病毒粒子存在的条件下以细胞_细胞的方式扩散。MX感染的HeLa细胞暴露于长期缺氧环境会导致病毒RNA转录增加，并通过HIF-1a依赖的机制提高病毒蛋白的水平。缺氧还会提高能够通过无细胞的介质传播LCMV感染的感染性病毒粒子的形成`。这种缺氧诱导的LCMV “重新活化”可能造成对健康不利的后果，例如对于发育中的胎儿和接受来自无临床症状供体的移植物的人而言。
[0314]实施例11:重组LCMV-NP片段的克隆和表达
[0315]通过PCR使用质粒pBluescript-NP作为模板克隆了 LCMV (MX)-NPcDNA的三个重叠片段，圆括号中的数字显示了相应于MX病毒株已公开的NP序列(GenBank登录号Y16308, Reiserova et al.2001)的位置。
[0316]含有氨基酸1-205的片段I使用如下设计的引物进行扩增:NPMXF1S5, -CCGAATTCATGTCTCTGTCCAAGGAAGTCA-3; (46-67) (SEQ ID NO:79)和NPMXFIA5' -GGCTCGAGGTMAGCAGACCAAGGTCTGTG-3' (660-639)(SEQ ID NO:80);
[0317]含有氨基酸198-391的片段II使用如下引物进行扩增:NPMXF2S5, -GGGAATTCCTCACAGACCTTGGTCTGCTTT-3' (637-658)(SEQ ID N0:81)和NPMXF2A5' -CCCTCGAGCACTGGATCATTGAACCTACCC-3' (1218-1197)(SEQ ID NO:82);和
[0318]含有氨基酸384-558的片段III通过用如下引物扩增获得:NPMXF3S5, -CCGAATTCGAGGGTAGGTTCAATGATCCAG-3; (1195-1226)(SEQ ID NO:83)和 NPMXF3A5' -CCTCGAGTTAGAGTGTCACAACATTTGGTC-3' (1722-1700) (SEQ ID N0:84)。所有引物均被设计成分别含有EcoRI和Xho I限制位点(下划线)。PCR反应使用上面列出的引物和EXT DNA聚合酶(Finnzymes, Oy, Finland)进行。在最初的94°C 3min初始变性后,扩增程序设定如下:变性 940C 30s，退火 600C 40s，和延伸 72°C lmin20s,总共 35 个循环，最后 72°C 7min。PCR 产物在 1.2% 琼脂糖凝胶上使用 Wizard? SV Gel&PCR 清理(clean-UP)系统(Promega, USA)进行纯化，并亚克隆到用EcoRV线性化并用dT加尾用于T-A克隆的pBluescript SK(+)(Stratagene, USA)中，或 pG.EM?-T 载体(Promega, USA)中。接着，使用 EcoRI 和 XhoI限制酶将所有三个片段与谷胱甘肽S转移酶对框地克隆到pGEX-4T-l (Amersham PharmaciaBiotech AB, Sweden)中。为了产生GST融合蛋白，将经验证的质粒构建体(命名为pGEX_4T1-NPI, pGEX-4Tl-NPII, pGEX-4Tl_NPIII)转化到大肠杆菌 BL21_CodonPlus (DE3)-RIPL (Stratagene, USA)感受态细胞中，并用 0.2mM IPTG(Sigma-Aldrich, USA, USA)诱导 3 小时。
[0319]实施例12:GST标志物的融合蛋白的纯化
[0320]大肠杆菌的诱导培养物通过离心沉淀，重悬浮在冰冷的裂解缓冲液STE(10mMNaCl, IOmM Tris-HCl, ImM EDTA，溶于 Ix PBS), pH8 中，用终浓度为 0.4mg/ml 的溶菌酶(Serva, Germany)在冰上孵育15min。对细菌细胞进行超声(2x30s)之前，向细胞悬液添加10%月桂酰基肌氨酸钠(Sigma-Aldrich, USA, USA) STE溶液至终浓度为1.5%，以及IMDTT (Sigma-Aldrich, USA, USA)至终浓度为5mM。不溶的材料通过4°C 12, OOOg离心15min加以除去。向细菌裂解物添加合适体积的用STE, pH8平衡的谷胱甘肽Sepharose4B (AmershamPharmacia Biotech) 50%浆液，并在4°C通过温和搅拌过夜孵育。第二天，用冰冷STE，pH8充分清洗结合在谷胱甘肽S印harose4B上的融合蛋白，并在室温下用15mM溶于50mMTris-HCl, pH8.0的还原谷胱甘肽(Merck)将其洗脱。通过SDS-PAGE确定纯化样品中融合蛋白的产量，并与规定浓度的BSA进行目测比较。
[0321]实施例13 =NP-1gG ELISA-1
[0322]用稀释于 0.05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9，6)中的纯化蛋白GST-NP I, GST-NPI I, GST-NPI11 和 GST(50ng/ 孔)在 37°C 下过夜包被微孔板孔。用 10% 脱脂乳PBS溶液+0.1%吐温20封闭后，用血清样品(50ml等分)孵育经包被的孔，血清样品用封闭溶液2倍稀释，起始为1:20，室温孵育I小时。平板用PBS-0，1%吐温20清洗4次，并用1:35000稀释于封闭溶液的过氧化物酶偶联的山羊抗人IgG(Sigma)室温孵育45分钟。清洗后，向每个孔添加底物溶液(10ml Mc Ilweine缓冲液pH5, 5100mM Na2HPO4, 40mM柠檬酸，IOmg邻苯二胺(Sigma), 10 μ I的30%Η202),在黑暗场合孵育5_10min。通过添加2MH2SO4终止反应，并用492nm吸光度测量光密度。用来自相应孔的OD减去阴性抗原包被孔的OD计算调整后的OD。
[0323]实施例14:通过阳性人血清对重组表达的GST-，NPI, GST-NPII,和GST-NPIII进行表位作图
[0324]为了确定NP上被NP特异性血清抗体识别的表位，根据实施例所述的操作流程进行ELISA。使用15份通过免疫沉淀方法确认为阳性的血清样品。
[0325]如图16所示，抗NP血清抗体优先识别位于NP片段III (含有氨基酸384-558)上的表位，而少部分抗体还与位于片段II (氨基酸198-391)上的表位反应。
[0326]实施例15 =NP-1gG ELISA-2
[0327]核蛋白(NP)特异性血清Abs的检测通过如下方法实施。96孔聚苯乙烯平板用浓度为6 μ g/ml稀释在0，05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(pH9，6)中的NP特异性单克隆抗体M87在4°C包被过夜。将平板用含0，1%吐温20和10%牛奶(每孔200 μ I)的PBS溶液(PBS-T)封闭1.5h，之后用以1:300稀释于封闭溶液中的细胞裂解物(用LCMV MX持续感染的HeLa细胞和未感染的HeLa)孵育lh。在一块平行的平板上，将人血清样品以1:20和1:60在封闭溶液中稀释。将总共每孔50 μ I稀释的血清样品转移到NP饱和的平板上，随后孵育I小时。最后，平板用1:35000稀释于封闭液中的HRP偶联山羊抗人IgG (Fe-特异性)抗体(SIGMA)孵育45min。HRP通过OPD颜色反应加以检测，通过添加50 μ 12Μ H2S04终止反应。光密度以492nm吸光度加以测量。所有步骤均在室温下进行。每个步骤之间，平板用PBS-T清洗4次。通过用相应孔的OD减去阴性抗原包被孔的OD计算经调整的0D。
[0328]或者，抗原使用浓度为4 μ g/ml的纯化重组LCMV NP。
[0329]为了发现合适的内部阳性和阴性对照，通过免疫沉淀并随后用NP特异性单克隆抗体免疫印迹对人血清进行分析(见实施例7)。随后，选择一个血清作为阴性对照，选择另一个作为阳性对照，用于随后的测试。然后，将25个已经用免疫沉淀试验证明是阴性的血清样品在NP ELISA中进行分析，然后将获得的经调整的OD值表达为内部阳性对照的百分比阳性(PP)，方法是用2次重复试验的平均调整OD值除以内部阳性对照的4次重复试验的调整OD值的中值，再乘以100。用这25个样品获得的平均PP值加上两个标准差确定为ELISA的截止值，其用作阳性和阴性血清样品之间的阈值。
[0330]使用这个方法，截止值被确定为4.2%，并用于随后的计算。
[0331 ] 实施例16:通过NP-1gG ELISA-2检测人样品中的抗LCMV-NP抗体
[0332]从⑴发生过自发流产但未诊断出原因的妇女；(ii)有过足月妊娠的妇女；和
(iii)患有肾细胞癌(RCC)的癌症患者获得血清样品。在实施例15所述条件下测试人血清中的抗-LCMV抗体，确定PP值并 示于表3。
[0333]表3:在经历过自发流产的人类女性受试者中检测抗-LCMV NP抗体
[0334]
【权利要求】
1.一种用于评估受试者中的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染状态或活性的方法，该方法包括:选择用于评估的受试者，其中该受试者曾经暴露于LCMV和/或具有LCMV活性增高的风险；从该受试者获得样品；使该样品与至少一种用于检测LCMV的组合物接触；和确定所述至少一种用于检测LCMV的组合物是否与来自该样品的LCMV标志物相缔合，其中检测到缔合表明该受试者被LCMV感染和/或具有活性LCMV。
2.权利要求1的方法，其中确定包括向该受试者和/或与该受试者有关的医疗从业者报告该受试者被LCMV感染和/或具有活性LCMV。
3.权利要求1的方法，其中确定还包括检测被LCMV感染和/或具有活性LCMV的受试者中的LCMV的水平和/或活性。
4.权利要求3的方法，进一步包括向该受试者和/或与该受试者有关的医疗从业者报告检测到的LCMV水平和/或活性。
5.权利要求1的方法，其中具有LCMV活性增高风险的受试者具有与缺氧相关的状况的风险。
6.权利要求5 的方法，其中该受试者是怀孕的、免疫受损的、移植接受者、具有癌症发生风险，或者患有癌症。
7.权利要求1的方法，其中所述用于检测LCMV的组合物包括至少一种与一种或多种LCMV核酸特异性结合的引物。
8.权利要求7的方法，其中所述至少一种引物包含10个或更多个核酸，其中该10个或更多个核酸与SEQ ID NO: 1-51中任一个之内的靶区域具有至少80%的同一性，从而使所述引物与该靶区域特异性结合。
9.权利要求7或8中任一项的方法，其中该引物选自下组:SEQID NO:58, SEQ IDNO:59, SEQ ID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ IDNO:67, SEQ ID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72,和 SEQID N0:73。
10.权利要求9的方法，其中该引物与编码LCMVNP的核酸结合。
11.权利要求10的方法，其中该引物包括与SEQID N0:58和SEQ ID N0:59具有至少80%同一性的核酸序列对，或者与SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67具有至少80%同一性的核酸序列对。
12.权利要求9的方法，其中该引物与编码LCMVGP的核酸结合。
13.权利要求12的方法，其中该引物包括与SEQID NO:60和61具有至少80%同一性的核酸序列对，或者与SEQ ID NO:68和69具有至少80%同一性的核酸序列对。
14.权利要求9的方法，其中该引物与编码LCMVZP的核酸结合。
15.权利要求14的方法，其中该引物包括与SEQID NO:62和63具有至少80%同一性的核酸序列对，或者与SEQ ID NO:72和73具有至少80%同一性的核酸序列对。
16.权利要求9的方法，其中该引物与编码LCMVL的核酸结合。
17.权利要求16的方法，其中该引物包括与SEQID NO:70和71具有至少80%同一性的核酸序列对。
18.权利要求9的方法，其中该引物与编码LCMVNP, LCMV GP, LCMV ZP和LCMV L中两种或更多种的核酸结合。
19.权利要求1的方法,其中所述用于检测LCMV的组合物包括至少一种分离的LCMV蛋白或其片段。
20.权利要求1的方法,其中所述用于检测LCMV的组合物包括至少一种分离的单克隆抗体或抗体片段。
21.权利要求20的方法，其中所述抗体或片段包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9217CB的杂交瘤MJ3产生的抗体。
22.权利要求20的方法，其中该抗体或片段包括由包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9216CB的杂交瘤M166产生的抗体。
23.权利要求20的方法，其中该抗体或片段包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9217CB的杂交瘤MJ3产生的抗体，和由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9216CB的杂交瘤M166产生的抗体。
24.权利要求20的方法，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR3(SEQ ID NO:78)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
25.权利要求24的方法，其·中抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR2(SEQ ID NO:77)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
26.权利要求25的方法，其中抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:76)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
27.权利要求20的方法，其中抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR3(SEQ ID NO:78)。
28.权利要求27的方法，其中抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR2(SEQ ID NO:77)。
29.权利要求28的方法，其中抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDRl(SEQ ID NO:76)。
30.权利要求20的方法，其中该抗体或片段包括与SEQID NO: 74具有同一性的抗原结合肽，其中:氨基酸序列内对应于SEQ ID NO:74内的互补决定区的区域包括一个或多个保守氨基酸替换；氨基酸序列内对应于SEQ ID NO: 74内的框架区的区域与SEQ ID NO: 74的相应区域具有至少80%的同一性；且该抗原结合肽与LCMV NP结合。
31.权利要求30的方法，其中该抗原结合肽是抗体或抗体片段。
32.一种用于评估样品中淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)感染状态或活性的诊断试剂盒，其中该试剂盒包括:至少一种与一种或多种LCMV核酸特异性结合的引物；至少一种LCMV蛋白或其片段；至少一种分离的LCMV结合抗体或抗体片段；或上述的任意组合。
33.权利要求32的试剂盒，其中该试剂盒包括至少一种与一种或多种LCMV核酸特异性结合的引物。
34.权利要求33的试剂盒，其中所述至少一种引物包含具有10个或更多个核酸的至少一种核酸引物，其中所述10个或更多个核酸与SEQ ID NO: 1-51中任一个之内的靶区域具有至少80%的同一性，从而使所述引物与所述一个或多个靶区域特异性结合。
35.权利要求33的试剂盒，其中所述引物选自下组:SEQID NO:58, SEQ ID NO:59, SEQID NO:60, SEQ ID NO:61, SEQ ID NO:62, SEQ ID NO:63, SEQ ID NO:66, SEQ ID NO:67, SEQID NO:68, SEQ ID NO:69, SEQ ID NO:70, SEQ ID NO:71, SEQ ID NO:72,和 SEQ ID N0:73。
36.权利要求33的试剂盒，其中该引物与编码LCMVNP的核酸结合。
37.权利要求33的试剂盒，其中该引物与编码LCMVGP的核酸结合。
38.权利要求33的试剂盒，其中该引物与编码LCMVZP的核酸结合。
39.权利要求33的试剂盒，其中该引物与编码LCMVL的核酸结合。
40.权利要求33的试剂盒，其中该引物与编码LCMVNP, LCMV GP，LCMV ZP和LCMV L中两种或多种的核酸结合。
41.权利要求32的试剂盒，其中该试剂盒包括至少一种分离的LCMV结合抗体或抗体片段。
42.权利要求41的试剂盒，其中所述抗体或片段包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9217CB的杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体。
43.权利要求41的试剂盒，其中该抗体或片段包括由包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9216CB的杂交瘤M166产生的单克隆抗体。
44.权利要求41的试剂盒，其中该抗体或片段包括由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9217CB的杂交瘤MJ3产生的单克隆抗体，和由保藏在位于比利时Ghent大学的比利时微生物保藏中心(BCCM)的LMBP保藏号9216CB的杂交瘤M166产生的单克隆抗体。
45.权利要求41的试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR3(SEQ ID NO:78)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
46.权利要求45的试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR2(SEQ ID NO:77)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
47.权利要求46的试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR1(SEQ ID NO:76)，其包含一个或多个保守氨基酸替换。
48.权利要求41的试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR3(SEQ ID NO:78)。
49.权利要求48的试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDR2(SEQ ID NO:77)。
50.权利要求49的 试剂盒，其中该抗体或片段包括单克隆抗体M87的重链可变区的CDRl(SEQ ID NO:76)。
51.权利要求41的试剂盒，其中该抗体或片段包括与SEQID NO: 74具有同一性的抗原结合肽，其中:氨基酸序列内对应于SEQ ID NO:74内的互补决定区的区域包含一个或多个保守氨基酸替换；氨基酸序列内对应于SEQ ID NO:74内的框架区的区域与SEQ ID N0:74的相应区域具有至少80%的同一性；且该抗原结合肽与LCMV NP结合。
52.权利要求51的试剂盒，其中该抗原结合肽是抗体或抗体片段。
【文档编号】C12Q1/70GK103597098SQ201280012143
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2012年1月6日 优先权日:2011年1月7日
【发明者】J.托马斯科瓦, J.科帕塞克, J.帕斯托雷克, S.帕斯托雷科瓦 申请人:斯洛伐克生物科学公司