专利名称：：用食油假单胞菌菌株有效防治病毒性植物病的制作方法
技术领域：
：本发明涉及具有防治植物病毒病活性的食油假单胞菌(I^eudomonasoleovorans)菌株；和包含它的用于防治植物病毒病的微生物制剂。
背景技术：
：园林作物的总种植面积逐年增长，然而，大多数园林作物中发生多种植物病毒病，导致严重的经济损失。损害园林作物的植物病毒包括黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaicvirus,CMV)、烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus,TMV)和马铃薯Y病毒(PotatovirusY，PVY)。为了防治这些病毒，开发了农艺防治方法(例如使用无病种子和培育抗病毒的新品系的那些方法)，但其效果并不显著。同时，通过向植物中引入基因(如衣壳蛋白基因、复制相关基因、卫星RNA基因和反义基因)开发了抗病毒的转基因植物，但要获得工业上的成功尚需时日(Fitchen，J.H.禾口Beachy，R.N.，Annu.Rev.Microbiol.,47:739-763,1993)。最近有很多开发新微生物制剂的研究采用微生物来防治植物病毒。尤其地，微生物制剂是环境友好的手段，其能保持自然生态系统并对哺乳动物无毒，因而对微生物制剂的需求在增加。发明概述因此，本发明的一个目的是提供有效防治植物病毒病的微生物；和包含它的微生物制剂。根据上述目的，本发明提供了具有防治植物病毒病活性的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)；其培养物；所述培养物的干粉；和用于防治植物病毒性疾病的微生物制剂，其包含作为活性成分的所述菌株、其培养物或所述培养物干粉。附图简述结合附图，本发明的上述的和其它目的和特征会从本发明如下描述中显而易见，附图分别显示图1:KBPF_004菌株的系统发生树；图21000倍稀释的KBPF-004的25%可湿性粉剂(WP)对烟草花叶病毒的防治活性；图3通过RT-PCR确证的KBPF-00425%WP对烟草花叶病毒的抑制作用；图4通过RT-PCR确证的KBPF-00425%WP对病毒单一或复合感染的抑制作用(C=Chungyang红辣椒；D=Daemyung辣椒；M分子大小标准参照物；H健康植物；N未处理组；和1，2:KBPF-004处理组)；图5:KBPF-00425%WP处理的病毒颗粒电子显微镜照片(TMV烟草花叶病毒；PVY马铃薯Y病毒)；图6:KBPF-00425%WP对烟草花叶病毒的感染抑制作用；图7:KBPF-00425%WP对辣椒斑驳病毒(peppermottlevirus)的防治作用；图8:KBPF-00425%WP对水稻条纹病毒的防治作用(A未处理组；B:500倍稀释的KBPF-004的25%WP处理组)；图9:KBPF-0042.5%颗粒剂对烟草花叶病毒的防治作用；和图10:KBPF-004的70%水悬浮剂(AS)对番茄黄化曲叶病毒的防治作用(A未处理组(市售杀虫剂处理组)；B:500倍稀释的KBPF-00470%水悬浮剂和市售杀虫剂处理组)。发明详述本发明提供具有防治植物病毒性疾病活性的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)菌株。食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)形成具有梳状条纹轮廓的黄色圆形集落。该菌株为23μm长、0.30.5μm宽的棒状，并有单条长鞭毛。本发明菌株具有SEQIDNO=I所示的1479bp核苷酸序列的16SrDNA，其与食油假单胞菌IAM1508T的序列有99.05%的序列同源性。通过依据Clustal法(ThompsonJD等，Nuc.Acid.Res.25:4876-82,1997)构建系统发生树(图1)来研究本发明菌株的分类地位。本发明菌株在其特异性的抗病毒活性方面不同于现有的食油假单胞菌。因此，该菌株被命名为食油假单胞菌KBPF-004，并于2002年1月11日保藏于韩国典型培养物保藏中心(KoreanCollectionforTypeCultures，KCTC)，登记号为KCTC10159BP。本发明还提供了有效防治植物病毒病的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)的培养物。可以通过将食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)细胞接种于培养基并使其发酵来制备所述培养物。培养基可没有任何限定地包含培养革兰氏阴性菌的培养基的常规成分。优选地，该培养基可在IL水中包含Ig至20g葡萄糖、Ig至30g酵母提取物、0.Ig至Ig硫酸镁、0.5g至5g磷酸二氢钾和0.5g至5g磷酸氢二钾。更优选地，该培养基可在IL水中包含7g至14g葡萄糖、15g至25g酵母提取物、0.1至0.2g硫酸镁、Ig至2g磷酸二氢钾和Ig至2g磷酸氢二钾。发酵可在20°C至40°C的温度下进行，优选至;34°C；通气速率为501/分钟至2001/分钟，优选1001/分钟至1201/分钟，旋转速度为IOOrpm至250rpm，优选120rpm至200rpmo为制备本发明的微生物制剂，优选菌株细胞和培养物滤液二者都使用。而且，本发明提供所述培养物的干粉。干粉可以通过灭菌、浓缩和粉碎(冷冻干燥和研磨)的步骤来制备。灭菌步骤可在培养完成后通过加热细胞培养物来进行，加热温度为80°C至120°C，时间为1至20分钟，优选90°C至100°C，5至10分钟。浓缩步骤可通过在40°C至80°C温度下将灭菌培养物减压浓缩12-48小时来进行，优选在65°C至75°C进行M至36小时。粉碎步骤可通过采用冷冻干燥或喷雾干燥法对浓缩培养物进行干燥处理，并将其研磨制成粉末培养物而进行，但并不限于该方法。冷冻干燥过程可通过从_80°C开始将温度顺次升高48至96小时(优选60至80小时)以干燥浓缩培养物来进行。研磨过程通过使用针磨粉碎机(pinmillgrinder)将所得的冻干产物研磨至2mm或更小的粒径来进行。微生物制剂可通过将所述细胞、所述培养物或培养物的干粉与表面活性剂、营养物和载体联合配制而制备。此外，本发明提供了用于防治植物病毒病的微生物制剂，其包含作为活性成分的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉。用于防治植物病毒性疾病的微生物制剂表现出依赖于活性成分浓度的抗病毒活性。本发明的微生物制剂可包含按重量计2.5至70%的食油假单胞菌KBPF_004(KCTC10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉；按重量计2-30%的表面活性剂；和剩余量的载体。优选地，本发明的微生物制剂可包含按重量计2.5至70%的食油假单胞菌KBPF-004(KCTC10159BP)细胞、其培养物或培养物的干粉。所述表面活性剂可包括阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或其混合物。表面活性剂可选自磺酸化合物的钠盐或钙盐，如c812烷基芳基磺酸盐、c812二烷基芳基磺酸盐、C8^12二烷基磺基琥珀酸盐、木质素磺酸盐、萘磺酸盐缩合物、萘磺酸盐福尔马林缩合物、C8^12烷基萘磺酸盐福尔马林缩合物和聚氧乙烯c812烷基苯基磺酸盐；硫酸盐化合物的钠盐或钙盐，如c812烷基硫酸盐、C8^12烷基芳基硫酸盐、聚氧乙烯c812烷基硫酸盐和聚氧乙烯C812烷基苯基硫酸盐；琥珀酸化合物的钠盐或钙盐，如聚氧化烯琥珀酸盐；阴离子表面活性剂，如苯甲酸钠和烷基羧酸盐；非离子表面活性剂，如聚氧乙烯C12^18烷基醚、聚氧乙烯c812烷基苯基醚、聚氧乙烯c812烷基苯基聚合物和环氧乙烷环氧丙烷共聚物’聚羧酸盐Jriton100；Tween80；和它们的混合物，但不限于此。载体可选自膨润土、滑石、粘土、高岭土、碳酸钙、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠岩、白炭(whitecarbon)、硫酸铵、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物，但不限于此。另外，可用所述表面活性剂和/或载体将本发明的微生物制剂制备成选自以下的形式可湿性粉剂(wettablepowder，WP)、水分散颗粒剂(waterdispersiblegranule,WG)、浓缩悬浮剂(suspensionconcentrate，SC)、颗粒剂、/K悬浮剂(aqueoussuspension,AS)、可溶性粉剂(solublepowder，SP)、水溶性颗粒剂(watersolublegranule,SG)和胶囊剂。在本发明中，细胞或培养物可以包含它的用于防治植物病毒病的微生物制剂的形式提供，或长期保存并在使用前与其它成分混合的独立储存形式提供。对于长期存放，细胞或培养物可以在-70°C以下储存在甘油储存液中，或以冻干形式储存。本发明提供的可湿性粉剂形式的微生物制剂可通过以下方法制备通过后处理过程获得培养物的干粉；向其中加入表面活性剂、营养物和载体；并将其混合。本发明提供的颗粒剂形式的微生物制剂可通过以下方法制备通过后处理过程获得培养物的干粉；向其中加入表面活性剂，载体和崩解剂；并将其混合。用于本发明的崩解剂可选自膨润土、滑石、dialite、高岭土、碳酸钙及其混合物。除了微生物细胞和/或发酵产物(微生物的培养物)之外，颗粒剂还可包含选自以下的成分表面活性剂、无活性载体、防腐剂、润湿剂、供应促进剂(supply-promotingagent)、吸引剂(attractingagent)、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV防护剂、缓冲剂或助流剂。本发明中提供的微生物制剂水悬浮剂可通过以下方法制备通过后处理过程无菌浓缩培养物；向其中加入选自以下的成分表面活性剂、防腐剂、润湿剂、供应促进剂、引诱剂(attractingagent)、UV防护剂和缓冲剂；并将其混合。本发明的微生物制剂可有效地防治大多数由以下病原性病毒组引起的植物病毒病例如，青葱X病毒属(Allexivirus)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)、大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)>毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹潜病毒组(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒组(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、南瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、长线状病毒属(Crinivirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、弯曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒属(Foveavirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、双粒病毒组(Geminivirus)、大麦病毒组(Hordeivirus)、等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)、黄矮病毒组(Luteovirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)、线虫传多面体病毒组(Nepovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Potyvirus)、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、马铃薯病毒属(Pomovirus)、温州蜜柑矮缩病毒属(&idwavirus)、Taastrupvirus、细病毒组(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组CTobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)及其组合。特别地，本发明的微生物制剂非常有效地防治包含棒状(线状)单链RNA的烟草花叶病毒组、马铃薯Y病毒组和细病毒组，包含环状单链RNA的南瓜花叶病毒组和包含环状单链DNA的菜豆金黄花叶病毒属。更特别地，本发明的微生物制剂对以下病毒显示出极佳的防治作用辣椒斑驳病毒(PepMoV)、辣椒轻型斑驳病毒(PMMoV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、番茄黄化曲叶病毒(TYLCV)、黄瓜绿斑点花叶病毒(CGMMV)、马铃薯Y病毒(PVY)、小西葫芦黄花叶病毒(ZYMV)、芜菁花叶病毒(TuMV)或水稻条纹病毒(RSV)等。以下实施例旨在进一步说明本发明而不限制其范围。实施例1:KBPF_004的分离和鉴定<1-1>KBPF-0Q4菌株的分离从忠清北道阴城郡的烟草田中收集含有烟草植物根的土样。用无菌蒸馏水稀释所收集的土样，将稀释液涂布到补充有IOOppm环己酰胺的TSA琼脂培养基上(Difco，Detroit,MI)，并在27°C下孵育以分离菌株纯培养物。<1-2>KBPF-0Q4菌株的鉴定在30°C下在MuellerHinton培养基(包含2.Og牛肉浸膏、17.5g酪蛋白、1.5g淀粉和17.5g琼脂)中将实施例<1_1>中分离出的菌株孵育M小时。分离出的菌株形成具有梳状条纹轮廓的黄色圆形集落。该菌株为23μπι长、60.30.5μm宽的棒状，，并有单条长鞭毛。为鉴定菌株的生物化学特征，进行了脂肪酸组成分析、BiologGN微孔板分析和API20NE分析，结果分别参加表1_3。〈表1>权利要求1.具有针对植物病毒病的防治活性的食油假单胞菌O^seudomonasoleovorans)菌株KBPF-004(KCTC10159BP)。2.权利要求1所述食油假单胞菌菌株的培养物。3.权利要求2所述培养物的干粉。4.权利要求3的干粉，其中所述干粉通过冷冻干燥或喷雾干燥制备。5.用于防治植物病毒病的微生物制剂，其包含作为活性成分的食油假单胞菌菌株KBPF-004(KCTC10159BP)、其培养物或所述培养物的干粉。6.权利要求5的微生物制剂，其包含按重量计2.5至70%的食油假单胞菌菌株、其培养物或所述培养物的干粉；按重量计2至30%的表面活性剂；和剩余量的载体。7.权利要求6的微生物制剂，其中所述表面活性剂为阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂或其混合物。8.权利要求6的微生物制剂，其中所述载体选自膨润土、滑石、粘土、高岭土、碳酸钙、硅石、浮石、硅藻土、酸性瓷土、沸石、珍珠岩、白炭、硫酸铵、尿素、葡萄糖、糊精、水及其混合物。9.权利要求5的微生物制剂，其形式选自可湿性粉剂(WP)、水分散颗粒剂(WG)、浓缩悬浮剂(Sc)、颗粒剂、水悬浮剂(AQ、可溶性粉剂(SP)、水溶性颗粒剂(SG)和胶囊剂。10.权利要求5的微生物制剂，其中所述植物病毒病由选自以下的植物病毒组引起青葱X病毒属(Allexivirus)、苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、葡萄卷叶病毒属(Ampelovirus)、大麦黄花叶病毒属(Bymovirus)、菜豆金黄花叶病毒属(Begomovirus)>毛状病毒组(Capillovirus)、香石竹潜病毒组(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒组(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、南瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、长线状病毒属(Crinivirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、弯曲病病毒科(Flexiviridae)、凹陷病毒属(Foveavirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、双粒病毒组(Geminivirus)、大麦病毒组(Hordeivirus)、等轴不稳定环斑病毒组(Ilarvirus)、黄矮病毒组(Luteovirus)、葡萄斑点病毒属(Maculavirus)、线虫传多面体病毒组(Nepovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Potyvirus)、植物呼肠孤病毒属(Phytoreovirus)、马铃薯卷叶病毒属(Polerovirus)、马铃薯病毒属(Pomovirus)、温州蜜柑矮缩病毒属(&idwavirus)、Taastrupvirus、细病毒组(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组CTobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)及其组合。全文摘要本发明涉及使用食油假单胞菌(Pseudomonasoleovorans)菌株对植物病毒病进行有效防治。本发明的整合了食油假单胞菌菌株的生物剂针对烟草花叶病毒(tobaccomosaicvirus)、马铃薯Y病毒(potyvirus)、细病毒(tenuyivirus)、黄瓜花叶病毒(koo-koomosaicvirus)和菜豆金黄花叶病毒(begomosaicvirus)的植物病毒感染提供极佳的防护。文档编号C12N1/00GK102239247SQ200980148301公开日2011年11月9日申请日期2009年12月1日优先权日2008年12月2日发明者张哲,李容溱,金亨珉,金南圭,黄仁天申请人:李容溱