专利名称：基因沉默治疗剂的脂质体有效递送方法和组合物的制作方法
技术领域：
本发明整体上涉及用于递送生物活性剂和药物试剂的方法、组合物和应用。本发明的方法和组合物可用于将治疗剂递送至所选的细胞、组织、器官或受治疗者。本发明的实施方式可以提供包括核酸试剂在内的药物和治疗剂的递送以及制备物质并利用其进行药物递送的方法。特别地，本发明涉及方法和包含脂质体或层状囊泡的组合物，和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及治疗方法和这些递送物质的应用。序列表本申请包含在此通过EFS-Web作为2009年10月14日创建的名为MD-08-16PCT. txt的ASCII文件提交的序列表，其大小为99，662字节，通过引用整体并入本文。
背景技术：
治疗性化合物向受治疗者的递送会因为受限于化合物到达靶细胞或组织的能力或受限于细胞内化合物的进入或通行而受到阻碍。治疗性物质的递送通常受限于细胞膜。 针对递送的这些屏障和限制可能导致需要使用比实现预期结果更高的化合物浓度，这样就带来了毒性作用和副作用的风险。某些治疗性化合物的递送的再一个制约是需要保护化合物在运输过程中免受降解。特别地，通过血液循环的全身递送可使所述化合物经受多种蛋白、酶以及免疫学成分和因子。一种递送策略是利用天然或合成的亲脂性载体分子或聚合物载体分子来改善化合物向细胞内的运输。这些物质可以充分利用为选择性进入细胞同时仍排除外源分子(如核酸和蛋白)而存在的机制。例如，阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并与细胞膜接触。还可以将某些天然的和合成的亲脂性分子并入(organize)作为药物试剂载体的脂质体或颗粒。纳米或亚微尺寸的脂质体可以充分利用为选择性进入细胞而存在的机制，例如细胞内吞作用。脂质体药物载体可以保护药物分子免受降解，同时改善细胞对其的摄取。而且，脂质体药物载体可以通过静电和其它相互作用包裹或结合某些化合物，并可以与带负电荷的细胞膜相互作用以启动跨膜运输。脂质体的缺点是治疗性脂质体制剂的生物学活性通常依赖于进入脂质体中的活性剂荷载程度。通常，期望高程度的荷载以提供高的治疗活性。此外，脂质体的荷载还需要保持在制剂内的额外的载体分子。脂质体用于药物试剂递送的另一个制约在于使用脂质体增加了递送制剂的质量。 治疗性制剂的生物学活性及其相对毒性将受到诸如用于制备制剂的亲脂性分子和载体之类的其它组分的性质和质量的影响。用于递送活性剂的常规基于脂质的脂质体制剂可具有脂质分子的质量与活性剂的质量比值高10至15倍率。通常，脂质或载体与活性剂的较低比率更有效并被人所期望。对于用于核酸试剂的此脂质体制剂，每个脂质体可以包含不高于数百拷贝的核酸试剂分子。其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi)、RNAi治疗、RNA药物、反义治疗和基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有效手段的需求。通常，核酸在细胞或血浆内仅保持稳定有限的时间。但是，基于核酸的试剂能够在随后可以被分散以用于细胞递送的组合物和制剂中保持稳定。需要用于全身和局部递送药物和生物学活性分子的方法、组合物和应用。其中，需要用于制备并使用提高了生物活性治疗分子的递送效率的递送结构和载体(包括脂质体形式)的方法。期望利用数量降低的载体物质，尤其对于脂质体制剂、基因沉默治疗剂和其它制剂，产生高效递送和高生物活性。
发明内容
本发明提供了用于细胞内和体内递送最终作为治疗剂的药物试剂的新型方法、组合物和制剂，其通常维持细胞保护作用且相对低毒。本发明的方法和组合物可用于将药物试剂递送至所选的细胞、组织和器官。在一些方面，本发明提供了向细胞递送活性核酸试剂或分子的过程、组合物和方法。所述活性剂可以或者通过药物作用或者通过产生RNA干扰或反义或核酶作用的应答， 而产生治疗或药理作用。本发明的活性剂可用于调节基因表达或用于基因治疗。本发明的实施方式提供了用于制备包括含有一种或多种活性剂的脂质体组合物在内的组合物的多种方法，所述方法通过提供包含活性剂的含水缓冲溶液的第一流体，提供包含处于有机溶剂中的一种或多种脂质体形成化合物的非水溶液的第二流体，使第一流体与第二流体撞击，由此形成所述有机溶剂浓度为约20%至约50% ν/ν的撞击流体 (impinging stream)。所述撞击流体的pH可以为约6至约7. 4。所述撞击流体可以在收集容器中于约20°C至约35°C的温度下温育约0. 5小时至约8小时，由此形成含有脂质体的温育物。在某些实施方式中，用于制备包含一种或多种活性剂的组合物的方法可以包括， 通过向所述温育物中加入足以使所述有机溶剂的浓度小于约20% ν/ν的缓冲剂而使所述温育物淬火。在一些方面，本发明的脂质体形成化合物可以为一种或多种DILA2氨基酸化合物。DILA2氨基酸化合物是含有可以形成脂质体的氨基酸基团的合成有机化合物。DILA2 氨基酸化合物可以在所述氨基酸基团的N-末端或C-末端或上述两端含有递送增强尾或亲脂性尾。在一些变式中，用于制备含有一种或多种活性剂的组合物的方法可以进一步包括使含有所述活性剂的第一流体的体积流率是含有脂质体形成分子的第二流体的体积流率的两倍或更高。在某些变式中，第一流体的体积流率是第二流体的体积流率的三倍或更高， 或者是第二流体的体积流率的五倍或更高。本发明的活性剂可以是化11 ^、含核酸的试剂、基因沉默剂、基因调节剂、反义试剂、肽核酸试剂、核酶试剂、RNA试剂或DNA试剂。在一些实施方式中，所述活性剂可以是药物化合物或小分子药物。用于制备含有一种或多种活性剂的脂质体组合物的方法可以进一步包括向收集容器中加入缓冲剂以调节所述有机溶剂的浓度。所述撞击流体的PH经调节可以为约3至约6。所述温育步骤可以在pH为约3至约6下进行。
在某些方面，所述活性剂可以以大于约50%、或大于约70%的水平被包裹在脂质体中。在一些方面，本发明可以提供在45°C的温度下保持基因沉默活性达7天的脂质体组合物。在某些方面，所述脂质体组合物可以在45°C的温度下保持包裹活性剂达7天。本发明的方法可以包括通过切向流过滤和渗滤而过滤所述温育物。在切向流过滤后，所述脂质体尺寸均一，其直径可以小于约160nm，或者平均直径可以为约40nm至约 160nm，或约80nm至约150nm。在进一步的实施方式中，所述温育物可以经灭菌，且所述有机溶剂可以用不同的药学上可接受的缓冲剂交换。在本发明的某些方法中，可以通过切向过滤和渗滤而对温育物进行过滤。在某些实施方式中，所述温育物可以经过灭菌。本发明的方法可以包括向第一流体中加入有机溶剂使其浓度为约至约40%
v/vo所述有机溶剂可以为(C1-6)烷醇浓度为约40%至约99% ν/ν或约70%至约95% 的无菌注射水溶液。本发明的方法的温育时长可以为约1小时至约4小时。本发明进一步涉及通过本发明方法的任一变式制备的药物组合物。总的来说，本发明包括用于向生物细胞递送治疗性核酸的方法。在一些实施方式中，本发明提供了通过根据本发明方法制备组合物并用所述组合物处理细胞而抑制生物细胞中的基因表达的方法。本文公开的抑制哺乳动物中基因表达的方法包括根据本发明方法制备组合物并向所述哺乳动物施用所述组合物。本发明的实施方式可进一步提供通过根据本发明方法制备组合物并向人施用所述组合物而治疗人类疾病的方法，其中所述疾病为癌、膀胱癌、肝癌、肝病、高胆固醇血症、 炎症性疾病、代谢疾病、炎症、关节炎、类风湿关节炎、脑炎、骨折、心脏病和病毒性疾病。本发明进一步涉及治疗疾病的组合物的应用和组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用。本发明提供了用于向细胞递送生物试剂的多种组合物和制剂。更特别地，在某些方面，本发明提供了大小为纳米级的脂质体制剂和载体颗粒。所述载体颗粒可以被荷载在脂质体内，在递送中可以显示提高的稳定性，并且可以有效地递送药物试剂以调节基因表达或活性。本发明提供了用于改善药物和生物活性分子的全身和局部递送的组合物、方法和应用。特别地，本申请还提供了用于制备和使用可以以提高的递送效率在细胞内递送活性剂的递送结构和载体的新型组合物和方法。在一些实施方式中，本发明提供了包含脂质体的组合物，所述脂质体含有一种或多种载体颗粒，每种载体颗粒都含有活性核酸试剂和肽其中，所述肽的质量和所述脂质体的质量之和与所述核酸试剂的质量的比率小于约15，或者小于约12，或者小于约10，或者小于约9，或者小于约8，或者小于约5.在某些实施方式中，本发明提供了在体内用于ApoB基因沉默的敲减活性为50% 或更高、或70%或更高、或者90%或更高的组合物。
在一些变式中，本发明的组合物可以包含含有氨基酸脂质的脂质体。在某些方面，本发明的组合物可以包含带电荷的载体颗粒、带负电荷的载体颗粒或者带正电荷的载体颗粒。在某些变式中，所述活性核酸试剂可以为RNAi诱导剂或反义试剂。每种脂质体均可以包含500或更高拷贝、或者1000或更高拷贝、或者5000或更高拷贝的活性剂分子。在一些变式中，用于载体颗粒的肽可以为可切割的肽或者可交联的肽。在一些实施方式中，所述肽是PN4110或PN183。本发明提供了用于向细胞递送活性核酸试剂的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并用所述组合物处理所述细胞。在某些方面，本发明提供了用于抑制细胞中基因表达的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并用所述组合物处理所述细胞。在某些方面，本发明提供了用于抑制哺乳动物中基因表达的方法，所述方法包括制备脂质体组合物并向所述哺乳动物施用所述组合物。在一些实施方式中，本发明提供了治疗人类疾病的方法，所述疾病选自包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症，该方法包括制备脂质体组合物并向人类施用该组合物。在某些实施方式中，本发明提供了脂质体组合物在制备用于治疗疾病的药物中的应用，所述疾病包括包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病， 肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症。在某些变式中，本发明提供了脂质体组合物用于治疗疾病的应用，所述疾病包括包括类风湿性关节炎的炎症性疾病，包括高胆固醇血症的代谢性疾病，肝病，脑炎，骨折，心脏病，包括肝炎和流感的病毒性疾病以及癌症。本发明的该发明内容和具体实施方式
以及附图、所附实施例和权利要求书整体上都作为本发明的公开内容。
图1 本发明的脂质体实施方式的示意图，其中某些脂质体形成化合物形成了双层囊泡10。在该实施方式中，所述脂质体的外层受到与一种脂质体形成分子的头部基团连接的聚乙二醇链20的保护。脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，所述脂质体囊泡包含活性干扰性RNA组分的负载，其包括缩合的RNA纳米颗粒40、 双链RNA双螺旋肽共轭物50、三链mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA 和具有平末端90的siRNA，这些组分并入本实施方式中。图2 用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。分别制备包括活性剂溶液、缓冲溶液和一种或多种脂质体形成化合物的溶液的试剂溶液并放置于容器 200中。使活性剂溶液和脂质体形成化合物的溶液在撞击流体210中接触。将撞击流体收集在收集容器220中。将所收集的物质置于所述容器中进行温育过程230，该步骤之后通过淬火240使所述物质稳定。使淬火的物质进行过滤过程250。滤液输出物260继续进行整理(finishing)过程。
图3 用于整理本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。所述脂质体组合物(可以为来自脂质体组合物的制备的滤液输出物)经灭菌300。用于运载经灭菌的组合物的器皿在310填装并在320整理，之后在330冷冻所述无菌组合物并在340储藏。将最终的组合物进行运输350以备使用。图4 用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。将活性剂溶液维持在容器400中。将含有脂质体形成组分(例如DILA2化合物或脂质体)的溶液维持在独立的容器410中。将缓冲溶液维持在另一个容器420中。利用独立的蠕动泵430以独立选择的流速抽吸溶液。所述溶液可以任选流过串联滤器或者在装入容器前过滤。在撞击过程中，所述活性剂溶液与含有脂质体形成组分的溶液在接触点434接触。所述撞击流体可以任选流过一个或多个混合管436。所述撞击流体进入收集容器440用于温育过程。淬火过程缓冲溶液可以任选维持在独立的容器450中。所述脂质体组合物460从收集容器440 流出并进入过滤过程。图5 用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。将来自收集容器的输出460的稳定化脂质体组合物置于容器500中。将经过渗滤的缓冲溶液维持在独立的容器520中。蠕动泵502提供了稳定化脂质体组合物从容器500经过含中空纤维膜的管 504的循环。切向流经由该循环而发生以通过除去滤液530而浓缩稳定化的脂质体组合物。 加入来自容器520的置换缓冲液可允许以固定或可变体积渗滤。任选地，可以利用蠕动泵 506进行稳定化脂质体组合物的渗析以驱动来自容器MO的渗析缓冲溶液。特定浓度的所述稳定化脂质体组合物被输出550至整理过程。图6 图6显示聚精氨酸结合区与增加聚精氨酸结合区长度的dsRNA的结合。 图6中，利用PN3499(总共含有10个精氨酸的二聚体肽)观察到最强的结合(具有取代 SYBR-Gold染料的最佳能力)。
具体实施例方式本发明的实施方式还提供了包括核酸试剂的药物和治疗剂的递送以及制备物质并利用其进行药物递送的方法。本发明进一步涉及可用于将各种分子和结构递送至细胞的新型药物递送增强方法和组合物。本发明提供了最终意在药物的递送、治疗剂以及疾病和病症的诊断和治疗、包括对受治疗者基因表达或活性调控产生响应的那些疾病和病症的诊断和治疗的多种方法、 化合物、组合物、制剂和应用。更具体地，本发明涉及方法和包含脂质体或层状囊泡的组合物，和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及这些递送物质的治疗方法和应用。本发明的方法和组合物可进一步用于递送治疗剂、预防剂和诊断剂，如核酸试剂、 多核苷酸、肽、蛋白以及小分子化合物和药物。本发明的组合物和方法可用于诸如包裹在脂质体或层状囊泡中的之类形式的治疗剂的递送。这些形式可以包括各种直径的纳米颗粒。其中，对调节性RNA的了解和RNA干扰(RNAi或iRNA)、RNAi治疗、RNA药物、反义治疗或核酶治疗以及DNA基因治疗的开发已经加大了对将活性核酸试剂引入细胞的有效手段的需求。通常，核酸在引入至细胞或血浆内时仅保持稳定有限的时间。但是，基于核酸的试剂能够被稳定在组合物和制剂中，然后所述组合物和制剂可以被施用并分散以用于细胞递送。核酸试剂包括含有核酸的任何分子，例如基因沉默剂、基因调节剂、反义试剂、肽核酸试剂、核酶试剂、RNA试剂和DNA试剂。在一些实施方式中，本发明的组合物和方法可用于递送包裹在脂质体中的治疗剂。在这些实施方式中，治疗剂可以称作负载。例如，图1显示了本发明的脂质体实施方式的示意图，其中某些亲脂性分子形成双层囊泡10。在该实施方式中，所述脂质体的外层受到与一种亲脂性分子的头部基团连接的聚乙二醇链20的保护。脂质体外层还有特异性靶向细胞或组织的配体30。在该实施方式中，所述脂质体囊泡包含活性RNA组分的负载，其包括缩合的RNA纳米颗粒40、双链RNA 双螺旋肽共轭物50、三链mdRNA 60、切丁酶底物RNA 70、具有长突出端80的dsRNA和具有平末端90的siRNA，这些组分并入本实施方式中。其它形式的治疗剂负载可以包括微RNA、 发夹RNA、DNA或核酶形式。通常，在本发明的方法和组合物中可以使用任何活性剂作为负载。在一些实施方式中，所述负载可以为小的有机分子药物试剂。在某些实施方式中，所述负载可以为带负电荷的治疗剂或中性治疗剂。本发明一些方面提供的方法和组合物可以以可释放形式或组合物递送治疗剂。可释放形式和组合物包括结合并释放活性剂的分子、结合活性剂并卸载有助于释放该试剂的部分(moiety)的分子、结合活性剂并随后在生物隔室内以有助于该试剂的释放的方式调节的分子，以及含有与释放介导剂化合物混合的活性剂结合的分子的组合物。在某些方面，本发明提供了用于制备适合递送治疗剂的脂质体组合物的方法和仪器。在某些实施方式中，本发明的活性剂为UsiRNA。本发明的方法可以提供核酸试剂的脂质体组合物，例如双链或三链RNA结构、RNA肽共轭物、缩合的RNA纳米颗粒、切丁酶底物 RNA、dsRNA、siRNA、微RNA、发夹RNA和其它活性RNA形式。本发明的活性剂可以为活性RNA试剂的肽缩合物。例如，通过缩合活性RNA试剂和肽或其它生物分子、RNA和多聚物质的缩合物而形成的纳米颗粒可以作为负载而荷载至本发明的脂质体组合物中。所述纳米颗粒可以为交联的。在进一步的实施方式中，本发明的活性剂可以为肽、蛋白、蛋白酶、抗体、单克隆抗体、基于抗体的药物、疫苗试剂或小分子药物。含有活性剂的组合物可以为含水溶液。本文使用的术语“含水溶液”是指水溶液、无菌水溶液或主体溶剂为水的任何溶液。含水溶液可以包含，例如一些有机溶剂。含水溶剂的实例包括水、注射用无菌水、Ringer溶液和等渗氯化钠溶液。含有脂质体形成分子或亲脂性分子的组合物可以为非水溶液。本文使用的术语“非水溶液”是指主体溶剂不是水的任何溶液。非水溶液可以包
含一些水。非水溶剂的实例包括易于与水、烷醇、(C1-6)烷醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、仲丁醇、 叔丁醇、烷醇-水、乙醇-水、乙腈、丙酮、甲酮、二甲基亚砜、表面活性剂溶液、去污剂溶液及它们的混合物混合的有机溶剂。用于脂质体组合物的方法
技术领域：
本发明的实施方式可以提供用于制备含有活性剂的含脂质体组合物的多种方法以及药物递送的方法。在一些方面，可以通过撞击两种组合物，例如含有一种或多种活性剂的组合物和含有一种或多种脂质体形成分子的独立的组合物而制备脂质体组合物。通常，本发明的脂质体结构在完成制备方法的所有步骤前不是以完全活性形式构成的。本发明方法的每个步骤都需要一定的时间。通常，脂质体组合物的形成比例将依赖于多种可变因素(例如流速、温度、PH和各组分的浓度)的组合的不可预测的作用。在一些实施方式中，使用温育时间以控制形成过程。图2显示了用于制备本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。图2中， 单独制备包括活性剂溶液、缓冲溶液和一种或多种脂质体形成化合物的溶液的试剂溶液并置于溶液容器200中。所述试剂溶液可任选单独过滤或者在无菌条件下制备。所述活性剂溶液和脂质体形成化合物的溶液在撞击过程210中接触。将撞击流体收集在收集容器220 中。将所收集的物质保持在容器中用于温育过程230，该步骤之后通过淬火240而使物质稳定。使淬火的物质进行过滤过程250。移除过滤输出物260至整理过程。本发明包括用于制备脂质体组合物的包括撞击过程的方法的实施方式。撞击过程可以具有通过使包含有活性剂的组合物与含有脂质体形成分子的组合物撞击而产生撞击流体的一个或多个步骤。在一些方面，本发明用于制备活性剂的脂质体组合物的方法可以具有温育过程的一个或多个步骤。温育过程可以包括收集撞击流体并将其保持在容器中持续温育时间。本发明的实施方式可进一步包括用于制备脂质体组合物的方法，其中所温育的组合物被淬火。可以通过加入溶剂、缓冲剂或稀释剂至所温育的组合物流体或组合物的混合物中而进行淬火。淬火可以将特定组分(例如有机溶剂或分散剂)的浓度稀释至预定水平以下。通常，所温育的组合物的淬火可以形成在进一步的过程或整理步骤中稳定的组合物。 淬火的步骤是可操作的以使所温育的可包含脂质体结构的组合物稳定。收集容器中撞击流体的温育以及方法的其它步骤可以提供其中的活性剂被脂质体高度包裹的脂质体制剂。例如，在某些实施方式中，本发明的脂质体组合物和结构的形成可需要撞击、混合、稀释、收集、温育、调节PH、淬火和过滤的任何步骤。 用于制备本发明的脂质体组合物的方法可以进一步包括一个或多个过滤步骤。过滤步骤可用于改变多种过程参数，例如控制或改变组分的浓度或者改变粒度或分散性以及其它物理溶液参数。图3显示了用于整理本发明的脂质体组合物的某些实施方式的流程图。参见图3， 所述脂质体组合物(可以为来自脂质体组合物的制备的滤液输出物)经灭菌300。用于运载无菌组合物的容器在310填装并在320后处理，之后在330冷冻所述无菌组合物并在340 储藏。将最终的组合物进行运输350以备使用。本发明涉及物质的灭菌、填装和整理至容器以及所形成的制剂的储藏的过程可以使用本领域已知的步骤和方法，例如Remington，s Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1990)中描述的那些。用于评价脂质体的包裹、大小和一般制备的一些方法描述在，例如W02001005374， 美国专利
发明者巴里·A·波利斯基, 皮埃罗·哈维, 罗格·C·阿达米, 贾亚·S·吉亚纳尼, 迈克尔·E·休斯顿, 迈克尔·V·滕普林, 雷切尔·E·约翰斯 申请人:玛瑞纳生物技术有限公司