专利名称：阳离子siRNA、合成以及用于RNA干扰的用途的制作方法
阳离子SiRNA、合成以及用于RNA干扰的用途本发明涉及阳离子SiRNA(小干扰核糖核酸)、其自动化合成以及其生物学应用， 所述生物学应用基于它们的细胞内穿透特性并且利用RNA干扰机制。RNA干扰是一种细胞内机制，其使得能够对内源或外源基因的表达进行序列特异 性控制。该机制的介体是与靶基因的片段具有相同序列的大约2圈的双链核糖核酸的小螺 旋，siRNA。虽然RNA干扰可能导致细胞染色质中靶基因的永久修饰，但在细胞中引入siRNA 的最直接的效应是靶信使RNA的失活。siRNA通常由包含3’-dTdT延伸的互补序列的两个 19-聚寡核糖核苷酸构成，但某些不完全的配对或直至27-聚的序列也可以是有效的。蛋白质的消失或者病毒RNA的选择性破坏可以具有在各个领域诸如癌学、变态反 应或传染病中有着重大利益的治疗性应用。不幸的是，完整的动物细胞对于核酸来说是不 可渗透的，正如关于将siRNA原样地引入到培养的或体内的细胞中所作的无成效的尝试所 显示的那样。然而，动物实验显示，肝脏(能够快速再生其细胞的器官)或肌细胞(其特别 地大而强壮)可以接收siRNA并且存活，在由注射过程而引起其细胞膜破裂的情况下。但 是，大体积液体的快速静脉内注射或者肌内注射的非常局部化的特点与在人治疗中的使用 是不相容的。在与过量的阳离子转运体相混合后可以达到将siRNA转染到细胞质中(细胞膜没 有破裂)。聚阳离子大分子例如聚乙烯亚胺或者阳离子脂质的聚集体能够起到该载体作用 (1)。这是因为，聚阴离子siRNA的分子与过量的转运体相聚集，从而形成精细的阳离子沉 淀物。这些颗粒使得能够通过存在于细胞表面上的阴离子硫酸乙酰肝素而有效地将siRNA 转染到大量的培养细胞中(2)。在动物中，情况不再相同。当注射到血液中时，这些颗粒被吞噬微生物颗粒的细胞 捕获并消化。当注射到组织或肿瘤中时，它们的大小(IOO-IOOOnm)阻止其向位于远离注 射位点的细胞扩散。然而，(3)和(4)的近期工作显示，通过用聚乙二醇残基覆盖这些颗粒 (隐形颗粒)，可以避免血液的吞噬细胞而又不完全抑制细胞结合。这些考虑促使发明人设想合成内在地为阳离子的siRNA，即经修饰的siRNA分子， 其中阳离子电荷抵偿了由核酸的磷酸所携带的阴离子电荷。任选地，这些化合物可能无需 载体就穿透入细胞中，并因而药物可能具有这样的优点，即其是分子的而不是颗粒的。为了既不扰乱siRNA与破坏信使RNA的蛋白质复合体的结合，也不扰乱通过杂交 对信使RNA的识别，化学修饰只可能在核酸的末端处。为了提高它们的细胞穿透性以便通过反义方法进行治疗，过去将为数非常多的化 学基序嫁接到寡核苷酸的末端。一些很近期发表的文章提及了在siRNA领域中的类似的尝
试ο2006年发表的第一篇文章提及通过二硫桥将聚乙二醇缀合至siRNA，但是细胞内 在化仍然需要通过与阳离子聚合物混合来进行非共价结合(5)。2007年，2篇文章描述了与包含7或8个阳离子电荷的各种阳离子肽相缀合的 siRNA(40个阳离子电荷)的用途。这些siRNA保持为非常阴离子的，并且就作者自己证明， 细胞内穿透性和效率没有提高(6)和(7)。
先前文章中所描述的在寡核苷酸上进行的聚阳离子的直接化学嫁接是可能的，但 是引起沉淀的问题，并且当操作包含与寡核苷酸数目相当的电荷数目的聚阳离子时，由于 阳离子聚合物的多分散性而可能导致不准确的表征。依靠通过与为了合成寡核糖核苷酸序 列本身所使用的相同的缀合化学来进行寡聚阳离子的顺次合成的技术，发明人克服了上述 问题。寡脱氧核糖核苷酸-寡聚精胺缀合物的自动合成是先前的国际PCT申请的目标(8)。已对于在该先前的PCT申请中所描述的化合物的合成/纯化/表征/保存进行 了重大的改进，因为2’ -OH基团的存在致使合成更加困难并且尤其是致使化合物更加不稳 定其去保护牵涉额外的步骤(痕量的RNA酶降解RNA)，精胺的铵/胺官能团是引起寡核 糖核苷酸_寡聚精胺缀合物水解的酸/碱催化剂。因此，本发明旨在提供内在地为阳离子的siRNA。本发明还旨在合成这些阳离子siRNA的方法，所述方法可以扩大到工业规模以便 进行GMP生产。根据另一个方面，本发明还旨在所述新型siRNA在制药和生物技术领域中的应用。本发明的阳离子siRNA的特征在于所述阳离子siRNA是双链RNA片段，在其末端 嫁接有寡聚阳离子(oligocations)，所嫁接的阳离子电荷的总数目相当于或大于由RNA链 的核苷间磷酸所携带的阴离子电荷的数目。出人意料地并且如通过实施例中给出的结果所证明的，此类阳离子siRNA能够在 没有任何转染试剂的情况下诱导RNA干扰现象。所述证明是在受控的环境中在培养的细胞 上进行的，其中总体上保持为阴离子的siRNA-阳离子寡肽缀合物不显示效应(见上)。“双链RNA”是指由在核糖的2’位置处存在除H之外的其他原子而引起的A类的 核酸双螺旋(与为B螺旋的DNA相反)。阳离子siRNA的总电荷Σ (即化学嫁接的阳离子电荷的总和)减去核苷间磷酸基 团的阴离子电荷的总和为-30至+50。这是因为，在没有载体的情况下，嫁接至具有序列SEQ ID NO :1GRKKRRQRRRPPQC 的 TAT 肽(电荷 +9)的 siRNA (电荷-40) ( Σ = -31)或嫁接至具 有序歹丨J SEQ ID NO :2RQIKIWFQNRRMKWKKC 的穿膜肽(penetratine)(电荷 +8)的 siRNA (电 荷-40) ( Σ = -32)不能够诱导RNA干扰现象(9)。RNA双螺旋的碱基互补性可以是完全的或部分的。在实施方案的一个变化形式中，每个寡核糖核苷酸在双螺旋的3’处具有单链延 伸。在另一个变化形式中，所述寡聚阳离子嫁接在有义链的3’或/和5’处或/和在 反义链的3’处，其中反义链是引导负责信使RNA降解的蛋白质复合体的那条链。在反义链 的5’位置处的嫁接取消了 RNA干扰效应。优选地，作为本发明的目标的阳离子siRNA由长15至30个核糖核苷酸，特别是19 至30个核糖核苷酸的双链RNA片段构成，在其末端通过共价键嫁接有1至3个寡聚阳离 子，所述寡聚阳离子的累计的阳离子电荷数目相当于或大于由RNA所携带的阴离子电荷的 数目。更特别地，本发明旨在阳离子SiRNA，其中至少一条链符合式⑴Ni-Aj 或 Aj-Ni (I)
其中.Ni表示i-聚寡核糖核苷酸，其中i = 15至30，特别是19至30，以及具有保持 siRNA的A型双螺旋的任何化学修饰或取代，
.Aj表示j-聚寡聚阳离子，其中j = 1-50，A符合-式(II)-HPO3-R1-(X-R2)nl-X-R3-O- (II)，其中R1、R2和R3是相同或不同的并表示低级亚烷基，X为NH或NC(NH2)2，nl = 2 至20 ；或者-式(III)-HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O-(III),其中R4、R5和R6是相同或不同的并表示低级亚烷基，并且X1选自腐胺、亚精胺或 精胺；或者-式(IV)-HPO3-R7- (aa)n2-R8-0-(IV),其中R7和R8是相同或不同的并表示低级亚烷基，(aa)n2为肽，其包含具有阳离子 侧链的天然氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸，并且n2 = 2至20。在本说明书和权利要求书中，“低级亚烷基”是指线性的、支化的或经取代的C1-C5
亚烷基。在本发明的一个优选的实施方案中，所述寡聚阳离子为寡聚胺(oligoamines)。有 利地，这些寡聚胺选自精胺、亚精胺或腐胺。有利地，相应的阳离子siRNA为具有结构(V)的寡核苷酸-寡聚精胺
—++十+
(N)i- [P03-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-0]jH (V)其中，N、i和j如上面所定义。RNA干扰的应用领域愈来愈广。制药和生物技术工业使用siRNA，以建立基因、疾 病和针对这些疾病潜在地有活性的分子之间的联系；这些基本上是在动物细胞上的高通量 筛选技术。本发明的阳离子siRNA使得能够简化该筛选，并且尤其是将该技术扩展至动物， 其中在临床前阶段中的化合物的验证之中将会考虑生理学、生物分布、排泄，从而提高成功 的机会并减少临床阶段中昂贵的失败。然而，siRNA的最大的潜力在于将它们直接用作用于抑制患者细胞中RNA或蛋白 质的生物合成的药物。因而，各种各样的病理学状态例如癌症、病毒感染、哮喘或自身免疫 性疾病都成为可治愈的。因此，本发明涵盖了阳离子SiRNA用于这些应用的用途。因此，本发明旨在用于用作药物的上面所定义的阳离子siRNA。更特别地，本发明旨在药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的至 少一种上面所定义的siRNA，以及与之相联合的药学上惰性的载体。本发明还旨在所述阳离子siRNA在分子生物学、功能基因组学中以及在筛选技术 中的应用。
本发明还旨在自动化合成阳离子SiRNA的链的方法，其特征在于，所述方法包括在固相支持物上以3’至5’顺次偶联核糖核苷酸，在这之前和/或之后顺次偶联 阳离子合成子，所述链符合式(VI) dT-dT- (N) i-Aj 或 Aj-dT-dT- (N) i (VI)其中，N、i、A和j如上面所定义。
更特别地，本发明旨在合成阳离子SiRNA的方法，其中所述阳离子合成子为亚磷 酰胺寡聚胺(oligoamines phosphoramidites)，并且符合-式(VII)P(OR9) (N(R10)2)-O-R1-(X-R2)nl-X-R3-O-Prot (VII),其中R1、R2、R3和nl如上面所定义，X为经保护的NH或NC(NH2)2, R9为-CH2CH2CN 或低级亚烷基，Rltl为低级亚烷基，或-N(Rltl)2为1-吡咯烷基、1-哌啶基或4-吗啉基，并且 Prot为在寡核苷酸合成中所使用的保护基团，例如DMT、MMT ；或者-式(VIII)P(OR9) (N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot (VIII),其中R4、R5、R6是相同或不同的并表示低级亚烷基，X1为具有合适的保护基团的腐 胺、亚精胺或精胺，R9和Rki如上面所定义；或者-式(IX)P (OR9) (N (R10) 2) -O-R7- (aa) ^-R8-O-Prot (IX)，其中R7、R8、R9、R1Q、n2和Prot如上面所定义，(aa)n2为肽，其包含具有经保护的阳 离子侧链的天然氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸，并且n2 = 2至 20。在本发明的一个优选的实施方案中，所述寡聚胺为寡聚精胺。本发明的其他特征和优点在下面的实施例中给出。寡核糖核苷酸-寡聚精胺缀合物的合成和纯化的特点以及相应的SiRNA的RNA干 扰的特性在这些实施例中详细描述，但并不是将本发明仅局限于这些化合物。特别地，描述 了靶向萤光素酶并包含直至30个精胺基序的21-聚体的合成。当阳离子电荷的数目接近 由相应的siRNA所携带的磷酸的数目时，观察到了在组成性地表达该基因的细胞系中萤光 素酶基因的特别重大且选择性的衰减。在这些实施例中，将参考
图1至6，其分别为图1 :HPLC分析，其显示了寡核苷酸<GL3ss>S5在水中的降解。图2 寡核苷酸 <GL3ss>Sn(其中 η = 0、1、3、5)和 <GL3as>Sn(其中 η = 0,1)的 HPLCif0图 3 :MALDI-T0F 质谱图。图4 根据精胺的数目而变化的萤光素酶基因的衰减。图5 根据siRNA的浓度而变化的萤光素酶基因的衰减。图6:特异性的控制。^MM 1 有下式的包含 η 个精fl安的 21-
3'dTdT - AGCUUCAUGAGUCGCAUUC5. -O、、N2^vvH
.OaO- H, H2^Jn
<GL3ss>Sn，其中<GL3ss>为21-聚寡核苷酸，S为磷酸精胺残基，η = 0、1、3、5、20、 30自动化合成在Expedite合成仪上，通过使用β-氰乙基(CE)亚磷酰胺化学， 固相合成了具有序列 SEQ ID NO :3(3，dTdT-A GCUUCAUGAGUCGCAUUC5，) 的一系列经保护的21-聚寡核苷酸<GL3ss>，其中的核糖核苷酸部分相应于存在于质粒 GL3 (Promega)中的Photinus pyralis萤光素酶基因的核苷酸153至171。树脂已包含2 个预先嫁接的脱氧胸苷。使用合成子精胺亚磷酰胺，以η个循环继续进行合成。获得了结 合在树脂上的具有下面结构的化合物(η = 0、1、3、5、20、30)。
权利要求
阳离子siRNA，其特征在于，所述阳离子siRNA是双链RNA片段，在其末端嫁接有寡聚阳离子，所嫁接的阳离子电荷的数目相当于或大于由RNA链的核苷间磷酸所携带的阴离子电荷的数目。
2.根据权利要求1的阳离子siRNA，其特征在于，所嫁接的寡聚阳离子的阳离子电荷总 和减去核苷间磷酸基团的阴离子电荷总和为-30至+50。
3.根据权利要求1或2的阳离子siRNA，其特征在于，在双螺旋中，链的互补性是完全 的或部分的。
4.根据权利要求1至3中任一项的阳离子siRNA，其特征在于，每个寡核糖核苷酸在双 螺旋的3’处具有单链延伸。
5.根据权利要求1至4中任一项的阳离子siRNA，其特征在于，所述寡聚阳离子嫁接在 有义链的3’和/或5’处和/或在反义链的3’处。
6.根据权利要求1至5中任一项的阳离子siRNA，其特征在于，所述片段由长15至30 个核苷酸，特别是19至30个核苷酸的双链RNA构成，在其末端通过共价键嫁接有1至3个 寡聚阳离子，所述寡聚阳离子的阳离子电荷总数目相当于或大于由RNA所携带的阴离子电 荷的数目。
7.根据权利要求1至6中任一项的阳离子siRNA，其特征在于，至少一条链符合式(I) Ni-Aj 或 Aj-Ni (I)其中.Ni表示i_聚寡核糖核苷酸，其中i = 15至30，特别是19至30，以及具有保持siRNA 的A型双螺旋的任何化学修饰或取代，.Aj表示j-聚寡聚阳离子，其中j = 1-50，A符合 -式(II)-HPO3-R1- (X-R2) nl-X-R3-0- (II)，其中R1、! 2和R3是相同或不同的并表示低级亚烷基，X为NH或NC(NH2)2，nl = 2至20 ；或者-式(III)-HPO3-R4-CH(R5X1)-R6-O- (III),其中R4、R5和R6是相同或不同的并表示低级亚烷基，并且X1选自腐胺、亚精胺或精胺；或者-式(IV)-HPO3-R7- (aa) n2-R8-0-(IV)，其中R7和R8是相同或不同的并表示低级亚烷基，(aa)n2为肽，其包含具有阳离子侧链 的天然氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸，并且n2 = 2至20。
8.根据权利要求1至7中任一项的阳离子siRNA，其特征在于，所述寡聚阳离子为寡聚胺。
9.根据权利要求8的阳离子siRNA，其特征在于，所述寡聚胺选自精胺、亚精胺或腐胺。
10.根据权利要求9的阳离子siRNA，其特征在于，所述阳离子siRNA为具有下述结构 的寡核苷酸_寡聚精胺(N)i- [PO3-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-NH2-(CH2)3-NH2-(CH2)4-OljH其中，N、i和j如在权利要求7中所定义。
11.根据权利要求1至10中任一项的阳离子siRNA，其用于用作药物。
12.药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含有效量的至少一种根据权利要求1 至11中任一项的阳离子siRNA，以及与之相联合的药学上惰性的载体、阳离子脂质或阳离 子聚合物。
13.根据权利要求1至10中任一项的阳离子siRNA在分子生物学和功能基因组学中的应用。
14.自动化合成根据权利要求1至10中任一项的阳离子siRNA的链的方法，其特征在 于，所述方法包括在固相支持物上以3’至5’顺次偶联19至30个核糖核苷酸，在这之前和/或之后顺 次偶联阳离子合成子，所述链符合式(VI) dT-dT-(N)i-Aj 或 Aj-dT-dT-(N)i (VI) 其中，N、i、A和j如在权利要求7中所定义。
15.根据权利要求14的方法，其特征在于，所述阳离子合成子为亚磷酰胺寡聚胺，并且符合-式(VII)P(OR9) (N(R10)2)-O-R1-(X-R2)nl-X-R3-O-Prot (VII),其中R1、R2、R3、nl如上面所定义，X为经保护的NH或NC(NH2)2，R9为-CH2CH2CN或低级 亚烷基，R10为低级亚烷基，或-N (R10) 2为1-吡咯烷基、1-哌啶基或4-吗啉基，并且Prot为 在寡核苷酸合成中所使用的保护基团，例如DMT、MMT ；或者 -式(VIII)P(OR9) (N(R10)2)-O-R4-CH(R5Xl)-R6-O-Prot (VIII),其中R4、R5、R6是相同或不同的并表示低级亚烷基，X1为具有合适的保护基团的腐胺、 亚精胺或精胺，R9和Rki如上面所定义；或者 -式(IX)P (OR9) (N (R10) 2) -O-R7- (aa) n2-R8-0-Prot (IX)，其中R7、R8、R9、R1Q、n2和Prot如上面所定义，(aa)n2为肽，其包含具有经保护的阳离子 侧链的天然氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、组氨酸、二氨基丙酸，并且n2 = 2至20。
全文摘要
本发明涉及阳离子siRNA，其特征在于，所述阳离子siRNA是双链RNA片段，在其末端嫁接有寡聚阳离子，所嫁接的阳离子电荷的数目相当于或大于由RNA链的核苷间磷酸所携带的阴离子电荷的数目。
文档编号C12N15/11GK101960009SQ200980107841
公开日2011年1月26日 申请日期2009年1月30日 优先权日2008年1月30日
发明者J-P·比尔, J-S·雷米, N·普方德, 小寺光治 申请人:国家科研中心