在糖化过程中的葡糖淀粉酶和布丘氏菌植酸酶的制作方法

专利名称：在糖化过程中的葡糖淀粉酶和布丘氏菌植酸酶的制作方法
技术领域：
描述的方法涉及葡糖淀粉酶和布丘氏菌(Buttiauxella spp.)植酸酶在淀粉转化 过程中的用途，例如，用于生产动物饲料的DDGS或在发酵过程中生产有机化合物，如乙醇。背景工业发酵方法主要使用葡萄糖作为生产多种终产物的原料，包括酶、蛋白质、氨基 酸、有机酸、糖醇、药物和其他生物化学品。在多种应用中，葡萄糖是由包含淀粉和纤维素的 底物(例如，磨碎的全谷物)的酶促转化产生的。加工淀粉产生葡萄糖通常涉及2个步骤， 即颗粒状淀粉的液化和液化淀粉的糖化来产生葡萄糖。其他步骤可以包括纯化和异构化， 例如当理想的终产物是纯化的葡萄糖或果糖时，或者发酵和蒸馏，例如当理想的终产物是 醇类时(例如，乙醇)。液化作用将淀粉聚合物颗粒的浆液转化为较低粘度的链长较短的糊精溶液。糖化 步骤进一步将这些较短链的糊精转化为葡萄糖。通常，淀粉的液化是通过暴露在升高的温 度下，并酶促生物转化。常规的酶促液化过程涉及向包含底物的浆液中添加热稳定的细菌 α -淀粉酶(例如，SPEZYME FRED或SPEZYME XTRA(DaniSC0 us, Inc,Genencor Division)或者TERMAMYL SC 或 TERMAMYL 120L (Novozymes))，所述底物包括颗 粒状淀粉。将PH调节至5.5至6.5之间，温度升高至高于90°C。首先将淀粉凝胶化，然后 暴露在糖化酶下。典型地，在存在葡糖淀粉酶(例如，来自黑曲霉(Aspergillus niger)的 葡糖淀粉酶(如，OPTIDEX L_400(DaniscoUS，Inc. Genencor Division)))、处于比液 化步骤使用的PH更酸的pH条件下进行糖化作用。典型的糖化步骤的pH是约pH 4.0-5.0。 然后，发酵所获得的糖，提供理想的终产物(例如，乙醇)。在生产乙醇的过程中，产生了副 产物和废物例如干酒糟及其可溶物(DDGS)，并用于饲料。此外，从该过程中获得的液体(例 如，酒槽水)通过与浆液混合而被循环利用。淀粉底物的液化和糖化作用存在多种变型。然而，对淀粉液化、糖化和发酵的进展 仍然存在需要。概述描述了在淀粉转化过程中涉及葡糖淀粉酶与植酸酶组合使用的组合物和方法。此 类过程可用于生产有机化合物(例如乙醇)，生产用于动物饲料的DDGS，或两者。在一些实 施方案中，组合物和方法包括在前糖化、糖化和/或组合的糖化/发酵的过程中，向淀粉转 化工序添加包含葡糖淀粉酶和植酸酶的酶混合物。此类组合物和方法提供了优于仅使用葡 糖淀粉酶的一些优势。在一些方面，本发明提供了发酵淀粉的方法，包括向待糖化的组合物添加任意顺 序的至少一种葡糖淀粉酶和至少一种布丘氏菌植酸酶的组合。在一些实施方案中，向已经历液化作用的组合物中添加至少一种葡糖淀粉酶和至少一种布丘氏菌植酸酶。在其他方 面，淀粉发酵为乙醇。在其他方面，产生具有降低的植酸的DDGS。在其他方面，产生包含活 性植酸酶的DDGS。在其他一些方面，产生酒糟水，并具有降低的植酸酶。在一些实施方案 中，酒糟水循环进入过程中。在一些方面，提供了生产醇类的方法，包括将包含淀粉底物的 浆液与至少一种α “淀粉酶接触产生寡糖；将寡糖与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸 酶接触，其中植酸酶获得自布丘氏菌(Buttiauxella spp.)，产生可发酵的糖；和在存在发 酵生物的条件下，发酵可发酵的糖以产生醇。在一些实施方案中，接触是同时发生的。在一 些实施方案中，在用α淀粉酶处理之后和添加葡糖淀粉酶之前，将温度提高到高于淀粉底 物的凝胶化温度。在一些实施方案中，淀粉底物是磨碎的谷物，且磨碎的谷物选自玉米、大麦、小麦、 稻、高粱、黑麦、粟和/或黑小麦。在一些实施方案中，至少一种葡糖淀粉酶具有与SEQ ID NO 5的序列至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，植酸酶也具有在92位氨基酸的丙 氨酸和/或至少一种下列氨基酸89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186 位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的 酪氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有至少一种下列 氨基酸改变A89T、D92A、Τ134Ι、F174S、Τ186Κ、Α188Ρ、Κ207Ε、A209S、S248L、Q256Y、Α261Ε 和Ν269Κ。在一些实施方案中，植酸酶是野生型布丘氏菌植酸酶(BP-WT)，或选自BP-Il和 ΒΡ-17的变体。在一些实施方案中，植酸酶具有SEQ ID NO :5、6、7和8中任一项给出的氨 基酸序列。在一些实施方案中，方法还包括将寡糖与至少一种其它/额外酶接触，所述酶选 自α “淀粉酶、第二种葡糖淀粉酶、第二种植酸酶、纤维素酶、支链淀粉酶、蛋白酶和/或漆 酶。醇可以是乙醇。在一些实施方案中，方法包括回收醇。在一些实施方案中，方法还可以 包括回收DDGS。本发明的其它方面包括降低乙醇发酵过程中的植酸的方法，包括将包含淀粉底物 的浆液与至少一种α-淀粉酶接触以产生液化物；在使产生可发酵糖的条件下，将液化物 与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO :5具有至少90% 氨基酸序列同一性，且其中植酸酶在92位具有丙氨酸；和在存在发酵生物的条件下，发酵 可发酵的糖，从而产生乙醇和/或DDGS。在一些实施方案中，该方法还包括将温度提高到高 于淀粉底物的液化温度的步骤。在一些实施方案中，将淀粉底物与至少一种葡糖淀粉酶和 至少一种植酸酶接触，并同时在存在发酵生物的条件下发酵可发酵的糖。在一些实施方案中，该方法包括回收乙醇和/或DDGS。在一些实施方案中，葡糖淀 粉酶来自丝状真菌，所述真菌选自木霉属(Trichoderma)、青霉属(Penicillium)、篮状菌 属(Talaromyces)、曲霉属(Aspergillus)和/或腐质霉(Humicola)。在一些实施方案中， 木霉是里氏木霉。在一些实施方案中，植酸酶是BP-17。在一些实施方案中，DDGS具有活性 剩余植酸酶。在一些实施方案中，DDGS可以混合到饲料中。在一些实施方案中，当DDGS与 谷类或饲料混合产生动物饲料时，活性植酸酶降低了饲料中的植酸。在一些实施方案中，淀 粉底物是磨碎的谷物，例如，玉米、大麦、粟、小麦、稻、高粱、黑麦和/或黑小麦。本发明的其它方面包括降低DDGS中的植酸的方法，包括将包含淀粉底物的浆液 与至少一种α-淀粉酶接触；在使产生可发酵糖的条件下，将淀粉底物与至少一种里氏木
5霉葡糖淀粉酶(TrGA)和至少一种植酸酶接触，其中植酸酶与SEQ ID NO :5具有至少90%氨 基酸序列同一性；和在存在发酵生物的条件下，发酵可发酵的糖以产生乙醇和/或DDGS。在 一些实施方案中，将淀粉底物与至少一种葡糖淀粉酶和至少一种植酸酶接触，与在存在发 酵生物的条件下发酵可发酵的糖是同时发生的。在一些实施方案中，植酸酶与SEQ ID NO 5具有至少95%序列同一性，且在92位氨基酸具有丙氨酸。在一些实施方案中，植酸酶是 野生型布丘氏菌植酸酶(BP-WT)，或选自BP-Il和BP-17的变体。还考虑了包含葡糖淀粉酶混合物与植酸酶的组合的单个组合物。此类混合物可以 在淀粉转化过程的前糖化、糖化和/或组合的糖化/发酵步骤的过程中添加。下文更详细的描述了本组合物和方法的这些和其他方面。
附图简介

图1显示了使用包含不同水平的BP-17植酸酶的酶组合物，在玉米的酵母发酵中 获得的DDGS的游离磷含量。序列简介SEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NOSEQ ID NO发明详述I.简介本组合物和方法涉及酶混合物，包括葡糖淀粉酶与至少一种植酸酶的组合，用于 淀粉转化过程，例如用于产生用于动物饲料的DDGS，或者用于生产有机化合物(例如，乙 醇)的发酵过程。组合物和方法可用于降低在糖化、发酵和/或同时糖化和发酵(SSF)过 程中的植酸，导致发酵产物或副产物(例如，DDGS和酒糟水)植酸降低。在一些实施方案中，植酸酶是布丘氏菌植酸酶或其变体。在一些实施方案中，植酸 酶具有与SEQ ID NO :5至少90%序列同一性，包括至少91%、至少92%、至少93%、至少 94 %、至少95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %，及高达并包括100 %。在一些 实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID NO :5至少90%序列同一性，包括至少91%、至少92%、 至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%，及达到并包 括100%，且还包括在92位的丙氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有与SEQ ID N0:5至少 90 %序列同一性，包括至少91%、至少92 %、至少93 %、至少94%、至少95 %、至少96 %、至 少97 %、至少98 %、至少99 %，及达到并包括100 %，且还包括在92位的丙氨酸，另外还具 有至少一种下列氨基酸序列特征89位的苏氨酸、134位的异亮氨酸、174位的丝氨酸、186 位的赖氨酸、188位的脯氨酸、207位的谷氨酸、209位的丝氨酸、248位的亮氨酸、256位的酪 氨酸、261位的谷氨酸和269位的赖氨酸。在一些实施方案中，植酸酶具有至少一种下列氨1是里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA)的氨基酸序列。2是TrGA的催化结构域的氨基酸序列，对应残基1-453。3是TrGA的接头区的氨基酸序列，对应残基453-491。4是TrGA的淀粉结合结构域的氨基酸序列，对应残基492-599。5是布丘氏菌植酸酶的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。6是布丘氏菌植酸酶变体D92A的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。7是布丘氏菌植酸酶变体BP-Il的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。8是布丘氏菌植酸酶变体BP-17的成熟蛋白质序列的氨基酸序列。
6基酸取代A89T、T134I、F174S、T186K、A188P、K207E、A209S、S248L、Q256Y、A261E 和 N269K, 具有或不具额外的取代D92A。在一些实施方案中，植酸酶是野生型布丘氏菌植酸酶，或变 体BP-Il或BP-17。在一些实施方案中，变体植酸酶具有布丘氏菌植酸酶的至少约50%的 植酸酶活性，包括至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，和甚至至少97% 的植酸酶活性。在一些实施方案中，葡糖淀粉酶获得自丝状真菌。在特定的实施方案中，葡糖淀 粉酶具有与里氏木霉葡糖淀粉酶(TrGA ;SEQ ID NO 1)至少约90%序列同一性，包括至少 91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少 99%，及高达100%。下文更详细的描述了本组合物和方法的这些和其他特征。II.定义除非另外说明，制造和使用本组合物和方法涉及在分子生物学、蛋白质工程、重组 DNA技术、微生物学、细胞生物学、细胞培养、转基因生物学、免疫学和蛋白质纯化中普遍使 用的常规技术。此类技术是本领域技术人员已知的，描述在多种教科书和参考文件中。虽 然示例了特定的方法和材料，但可以使用相似或等同的方法和材料制造或使用组合物和方法。除非另外定义，所有的技术和科学术语都应该符合其通常含义。为了清楚起见，定 义下列术语“ α淀粉酶”是α -1，4-葡聚糖_4_葡聚糖水解酶(Ε. C. 3. 2. 1. 1)，具有切割或水 解淀粉中的内部α-1，4_糖苷键的能力(例如，支链淀粉或直链淀粉聚合物)。术语“颗粒状淀粉水解(GSH)酶”和“具有颗粒状淀粉水解(GSH)活性的酶”指具 有水解颗粒形式淀粉的能力的酶。术语“功能等同物”指这样的分子(例如酶)，所述分子具有与另一种分子相同的 功能特征(如酶促活性)。术语“变体”当用于指代酶(例如，α "淀粉酶、葡糖淀粉酶、酸性真菌蛋白酶、植 酸酶等)时，指源自亲本酶但与亲本酶相比具有一个或多个氨基酸的取代、插入或缺失的 酶。该术语还包括杂交形式的酶，其中例如，酶可以具有源自芽孢杆菌(例如，地衣芽孢 杆菌(B. Iicheniformis))的C末端，和源自不同的芽孢杆菌(例如，嗜热脂肪芽孢杆菌 (B. stearothermophiIus))的N末端，或反之亦然。与亲本酶相比，变体可以具有一种或多 种改变的性质，例如增加的热稳定性、增加的蛋白水解稳定性、增加的比活、更宽的底物特 异性、更宽的PH范围内的活性、对抑制的抗性(例如，底物)或其组合。“亲本酶”指用作修 饰起点的酶。亲本酶可以是天然存在的或“野生型”的酶。如本文中使用的，“液化”或“使液化”指将淀粉转化为较短链的、较低粘度的糊精 的过程。如本文中使用的，“糊精”指葡萄糖的短链聚合物(例如，2-10个单位)。如本文中使用的，术语“淀粉”指包含复杂多糖碳水化合物(淀粉和支链淀粉)的 任何物质，其具有通式(C6HltlO5)x，其中χ是任意值。如本文中使用的，术语“颗粒状淀粉”意指粗淀粉，即，未经历凝胶化温度的淀粉。如本文中使用的，术语“糖化酶”和“葡糖淀粉酶”是可互换使用的，指能够催化
7D-葡萄糖从淀粉和相关的寡糖和多糖的非还原端释放的任意酶。如本文中使用的，术语“寡糖”指具有以糖苷键连接的2-10个单糖单位的分子。单 糖可以是葡萄糖和/或其他的糖。寡糖包括糊精和淀粉。如本文中使用的，术语“可发酵的糖”指能够被发酵生物发酵的糖。可发酵的糖包 括但不限于寡糖和糊精。如本文中使用的，术语“右旋糖等同物”或“DE”指用于测量总还原糖浓度的工业 标准，在干重基础计算为D-葡萄糖。未水解的颗粒状淀粉具有几乎为0的DE，D-葡萄糖具 有100的DE。如本文中使用的，术语“总糖含量”指在淀粉组合物中存在的总糖含量。“总糖含 量”可以在过程中的多个时间或点测量。如本文中使用的，术语“干燥固体”或“ds”指在浆液中的总固体，表达为基于干重 的百分比。如本文中使用的，涉及氨基酸或核苷酸序列时，“百分比(％ )序列同一性”指在 一条序列中与另一条序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比， 如通过比对序列并需要时引入空位以实现最佳比对(即，最大百分比序列同一性)而确 定，且在确定序列同一性时不考虑保守取代。实施序列比对和确定序列同一性的方法是 已知的，并且可以在不进行过度实验的条件下实施而获得确定值。多种算法可用于比对 序列和确定序列同一性，包括但不限于:Needleman等人，(1970) J. Mol. Biol. 48 443的同 源性比对算法，Smith等人，(1981) Adv. Appl. Math. 2 482的局部同源性算法；Pearson等 人，(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 2444 的相似性搜索方法；Smith-Waterman 算法， (1997)Meth. Mol. Biol. 70 :173_187 ；BLASTP、BLASTN和 BLASTX算法(参见，Altschul 等人， (1990) J. Mol. Biol. 215 403-410)。使用这些算法的计算机程序也是可获得的，包括但不限 于ALIGN 或 Megalign (DNASTAR)软件，或 WU-BLAST-2 (参见例如，Altschul 等人，(1996) Meth. Enzym. 266 460-480)；或 GAP、BESTFIT、BLAST (例如，Altschul 等人，见上文；FASTA 和 TFASTA，可获得自 Genetics Computing Group (GCG)包，第 8 版，Madison，Wis. ,USA)；和 Intelligenetics, Mountain View, CA, USA 的 PC/Gene 程序中的 CLUSTAL。本领域技术人员知道如何确定测量比对的合适参数，包括在待比较的序列全长实 现最大比对所需的算法。在一些实施方案中，使用程序的缺省参数确定序列同一性。在 一些实施方案中，可以通过在 MSPRCH 程序(Oxford Molecular, Accelrys Ltd.，Oxford England)实现的Smith-Waterman同源性搜索算法确定序列同一性(参见例如，(1997) Meth. Mol. Biol. 70 173-187)，使用按下列搜索参数的仿射空位搜索空位开放罚分12，空 位延伸罚分1。在一些实施方案中，可以使用Genetics ComputerGroup，Inc. ,Madison,Wis. 的GCG序列分析软件包的GAP程序进行成对氨基酸比较，其中使用bloSum62氨基酸取代矩 阵，空位权重12且长度权重为2。在一些实施方案中，涉及两条核酸序列的最佳比对时，变 体氨基酸序列的连续片段相对于参照氨基酸序列可具有至少一个额外的氨基酸残基，或具 有至少一个缺失的氨基酸残基。用于与参照氨基酸序列比较的连续片段包括至少约20个 连续的氨基酸残基，并可包括至少约30、至少约40、至少约50或更多个氨基酸残基。可以 通过设定空位罚分来校正与衍生物的氨基酸序列中包含空位相关的增加的序列同一性。当相对于GENBANK DNA序列数据库和其它公共数据库中的核酸序列评估给定的核酸序列时，通常使用BLASTN程序进行序列搜索。在一些实施方案中，BLASTX程序 优选用于针对GENBANK 蛋白质序列和其它公共数据库中的氨基酸序列，搜索已经 在所有可读框中翻译的核酸序列。BLASTN和BLASTX都通常用缺省参数运行，开放空位罚分 为11.0，延伸空位罚分为1.0，并使用BL0SUM-62矩阵(参见例如，Altschul等人，(1997))。选定序列的比对可用于确定两条或多条序列之间的％同一性(该术语在本文中 可与术语％同源性互换使用)。在一些实施方案中，MacVector 6. 5版中的CLUSTAL-W程序 用缺省参数操作，包括开放空位罚分为10. 0，延伸空位罚分为0. 1，并使用BLOSUM 30相似 性矩阵。如本文中使用的，术语“磨碎的”指减小了尺寸的植物材料，例如通过研磨、粉碎、 分级分离或任何其它减小或分选颗粒尺寸的方法。该术语涵盖了干磨法和湿磨法。“干磨 法”指研磨干燥的全谷类，而“湿磨法”指首先在水中浸泡谷类(即，浸透的)使谷类软化的 方法。如本文中使用的，术语“凝胶化”指淀粉分子的增溶作用，通常通过在升高的温度 下蒸煮，形成粘稠的悬浮液。如本文中使用的，术语“凝胶化温度”指含淀粉底物开始凝胶化的温度。在一些实 施方案中，这是含淀粉底物开始凝胶化的最低温度。凝胶化的确切温度依赖于存在的淀粉 的特定形式，并且可以随这样的因素改变，所述因素是例如植物种类、环境条件、生长条件 和其它参数。如本文中使用的，术语“低于凝胶化温度，，指低于凝胶化温度的温度。如本文中使用的，术语“浆液”指包含不溶性固体(例如，颗粒状淀粉)的水性混 合物。如本文中使用的，术语“发酵”指微生物对有机物质的酶促降解，来产生更简单的 有机化合物。当发酵发生在厌氧条件下时，该术语并非意在仅限于严格厌氧条件，发酵也可 以在存在氧气的条件下发生(例如，在微量需氧和其它条件下)。如本文中使用的，短语“同时糖化和发酵”或“SSF”指生产终产物的方法，其中发 酵生物(例如，产乙醇微生物)和至少一种酶(例如糖化酶)组合在相同容器中的相同方 法步骤中。如本文中使用的，术语“酒糟水”意指从固体中分离的釜馏物的液体部分(例如， 通过筛选或离心)，其含有悬浮的细小颗粒和不溶的材料。术语“涡流(backset)”通常用 于意指循环的酒糟水。如本文中使用的，术语“终产物”指从可发酵底物酶促转化的碳源来源的产物。在 一些实施方案中，终产物是醇类(例如，乙醇)。如本文中使用的，术语“源自，，涵盖了术语“起源自”、“获得自”、“可获得自，，和“分
离自”。如本文中使用的，术语“发酵生物”指适合在直接或间接生产终产物的发酵方法中 使用的微生物或细胞。在一些实施方案中，发酵生物是真核的(例如，真菌)，而在其它情况 下是原核的(例如，细菌)。如本文中使用的，术语“乙醇生产者”或“产乙醇微生物”指能够从单糖或寡糖产 生乙醇的发酵生物。
如本文中使用的，术语“回收”、“分离”和“分开”指从其天然相关的至少一种组分
中移出蛋白质、细胞、核酸或氨基酸。如本文中使用的，术语“多肽”和“蛋白质”可互换的使用，指通过肽键相连 的一系列氨基酸残基。使用氨基酸残基的常规单字母或三字母密码。3字母密码与 IUPAC-IUB 生物化学命名法联合委员会(IUPAC-IUB JointCommission on Biochemical Nomenclature(JCBN)) 一致。可以理解，由于遗传密码的简并性，可通过一种以上的核苷酸 序列编码多肽。除非另外说明，氨基酸序列从左至右按氨基至羧基方向书写。如本文中使用的，术语“植酸酶”指能够催化磷酸酯(包括植酸)水解，并释放无 机磷酸和肌醇的酶。在一些实施方案中，除了植酸，植酸酶还能够水解至少一种中等程度磷 酸化的肌醇-磷酸酯。如本文中使用的，术语“野生型”指天然存在的(天然的)多肽或多核苷酸。在一 些情况下，术语野生型可与术语“亲本”或“亲本序列”互换使用。如本文中使用的，术语“接触”和“暴露”指将至少一种酶与其同族底物置于足够 接近，使酶能够将底物转化为至少一种终产物。终产物可以是“目标产物”(即，终产物是发 酵反应的理想结果)。“接触”包括将包含酶的溶液与同族底物混合。如本文中使用的，除非上下文清楚地说明，单数术语“一”、“一个”和“这个”都包 括复数形式。因此例如，称组合物含有“一种化合物”包括两种或多种化合物的混合物。术 语“或”通常意指“和/或”，除非上下文另外清楚地说明。出于方便而提供标题，在一处标题下提供的描述可以等价的用于公开文本的其它 部分。所有引用的种类和范围都可以通过合适的语言或附加条件清楚地囊括或排除。数值范围包括了定义该范围的数值。当提供了值的范围时，可以理解也特定的公 开了在范围上下限之间的各中间值，到下限单位的十分之一(除非上下文另外清楚地说 明)。较小范围的上下限可以独立地包括在该范围内或排除在该范围外。不论上文还是下文，本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物都通过引用全 文并入到本文中。III.示例性实施方案A.葡糖淀粉酶多种葡糖淀粉酶(GA) (E. C. 3. 2. 1. 3)都可根据本组合物和方法使用。在一些实 施方案中，GA是由细菌、植物和/或真菌内源性表达的，而在其它实施方案中，GA对宿主细 胞(例如，细菌、植物和/或真菌)是异源的。在一些实施方案中，GA是由丝状真菌和酵 母菌株产生的，例如，由曲霉和木霉的菌株生产的可商购的GA。合适的GA包括天然存在 的野生型酶及其变体和遗传改造的突变的酶，例如杂合GA。杂合GA包括具有来自一种生 物体的GA(例如，篮状菌(Talaromyces)GA)的催化结构域和来自另一种生物体的GA(例 如，木霉GA)的淀粉结合结构域。在一些实施方案中，在淀粉结合结构域(SBD)或催化结 构域中包括接头。下列所述是适合使用的示例性GA:黑曲霉(Aspergillus niger)Gl和 G2GA(参见例如，Boel 等人，(1984)EMB0J. 3 1097-1102 ；WO 92/00381、WO 00/04136 禾口 USP 6, 352, 851)；泡盛曲霉(Aspergillus awamori)GA(参见例如，WO 84/02921)；米曲霉 (Aspergillusoryzae)GA(参见例如，Hata 等人，(1991)Agric. Biol. Chem. 55 :941_949)；和 Aspergillus shirousami GA(参见例如，Chen 等人，(1996)Prot. Eng. 9 499-505 ；Chen 等
10人，(1995) Prot. Eng. 8 :575_582 ；禾口 Chen 等人，(1994) Biochem J. 302 :275_281)。其他的GA包括从以下菌株获得的GA:篮状菌菌株(例如，埃默森篮状菌 (T. emersonii)、T. leycettanus、Τ. duponti 和嗜热篮状菌(T. thermophilus)(参见例如， WO 99/28488 ；美国专利号RE 32，153 ；美国专利号4，587，215)；木霉菌株(例如，里氏木 霉)；根霉菌株(例如，雪白根霉(R. niveus)和米根霉(R. oryzae))；毛霉(Mucor)菌株和 腐质霉(Humicola)菌株(例如，灰色腐质霉(H. grisea)(参见例如，Boel等人，(1984)EMBO J. 3 1097-1102 ；WO 92/00381 ；WO 00/04136 ；Chen 等人，(1996)Prot. Eng. 9 :499_505 ； Taylor 等人，(1978) Carbohydrate Res. 61 :301_308 ；美国专利号 4，514，496、4，092，434 和 4，618，579 Jensen 等人，(1988) Can. J. Microbiol. 34 :218_223 ；和 WO 2005/052148 的 SEQ ID NO 3)；以及与美国专利
发明者B·保尔森, J·舍蒂, O·兰特罗, S·布莱尼曼 申请人:丹尼斯科美国公司