积滤灭的10XYNB(13. 4mg/ml)和1000 X生物素化4mg/ml);
[0042] 所述BMMY培养基的成分包括：2%蛋白腺，1 %酵母粉，m°C灭菌20min，冷却后加 入相应体积滤灭的10XYNB(13. 4mg/ml)和1000 X生物素0). 4mg/ml)和0. 5%甲醇。
[0043] 阳忡转化子的筛洗 W44] 取100y1的上述发酵液于900y1的lOmg/ml的大麦葡聚糖底物中，在抑5. 0， 50°C条件下，反应lOmin，加入1. 5ml的DNS，于沸水中煮lOmin，立即至于冰水中冷却至室 溫，540nm测定其吸光度。不同转化子之间的吸光值的比较，从而筛选出具有较高酶活力的 表达菌株（CBHI-EGI和CBHI-EGII)。
[0045] 实施例4.转化子的诱导培养和纤维素酶活测定
[0046] 转化子的诱导培养
[0047] 将具有较高酶活力的编码CBHI-EGI和CBHI-EGII的阳性转化子在50ml的Yro培 养基中，30 °C，ISOrpm培养2天。取300y1培养液转接到300ml的BMGY培养基中，30 °C， 18化pm培养2天。取100y1的BMGY培养液转接到100mL的BMMY培养基中，在甲醇的诱 导下，继续于30°C，180巧m培养2天。将诱导的转化子的培养液转移至250mL离屯、管中， 12,OOO巧m离屯、lOmin，收集上清液（即发酵液），备用于纤维素酶的酶活检测。
[0048] 所述Yro培养基的成分包括：2%蛋白腺，2%葡萄糖，1%酵母粉，115 °C灭菌 30min。
[0049] 纤维素酶活测定
[0050] 对具有较高酶活力的阳性转化子的发酵液（CBHI-EGI和CBHI-EGII)进行纤维素 酶活的测定。分别测定纤维素酶滤纸酶活、PASC酶活、CMC-Na的酶活和大麦葡聚糖的酶活。
[0051] 纤维素酶滤纸酶活的测定：纤维素酶的滤纸酶活（FPaseactivity)采用Whatman 一号滤纸，参照IUPAC标准方法进行测定。将Whatman1号滤纸制成6cm长、Icm宽的形 状巧Omg左右），折成4折，成M型。将滤纸条置于试管底部，加入含0.05%苯甲酸钢的巧 樣酸一憐酸氨二钢缓冲液化05M、抑5. 0) 1. 5ml，50°C水浴平衡后，加入已经稀释的酶液 0. 5ml(空白先不加），混合均匀，使管内溶液浸没滤纸。50°C水浴保溫1小时，迅速冷却。 向各试管中加入3mlDNS试剂，再向空白中加酶液0. 5ml，混合均匀。在沸水中煮lOmin， 迅速冷却，用蒸馈水定容至25ml。WO号管为参比，测定540皿的吸光度。1Jimol的液体 酶，在50°C、pH5.O的条件下，每小时水解滤纸底物，产生1ymol还原糖（W葡萄糖计）所 需要的酶量定义为一个酶活力单位扣)。酶活测定结果见图3(A)。结果显示了CBHI、EgI、Egll、CBHI-Egl、CBHI巧gll和CBHI-EgII降解滤纸的比活分别为：1396U/ymol、4795U/ ymol、1578U/ymol、5582U/ymol、3320U/ymol和 8405U/ymol。从结果中可W看出， CBHI-EgI和CBHI-EgII的比活均较CBHI、EgI和EgII有显著的提高，并且CBHI-EgII的比 活是CBHI巧gll的2. 5倍。
[0052] 纤维素酶PASC酶活的测定：采用溶胀性纤维素（PASC)作为底物进行测定。将 IOg的微晶纤维素Avicel加入到250ml的85%H3PO4溶液中，并在4°c揽拌Ih;加入到化 的预冷的水中，在4°C静置30min;倾斜倒入离屯、管中，去除大块的沉淀，4°C，200化pm,离屯、 lOmin，弃上清；用1%NaHC〇3的悬浮沉淀，4°C，2000巧m,离屯、lOmin，弃上清；用100mL的 含0. 05%苯甲酸钢的巧樣酸一憐酸氨二钢缓冲液（0. 05M、pH5. 0)悬浮，并取Iml的样品， 3个平行，来确定其最终浓度。在各试管中0. 9ml的PASC溶液，50°C水浴平衡后，加入已经 稀释的酶液0.5ml(空白先不加），混合均匀。50°C水浴保溫60min，迅速冷却。向各试管中 加入1. 5mlDNS试剂，再向空白中加酶液0. 1ml，混合均匀。在沸水中煮lOmin，迅速冷却。 W0号管为参比，测定540皿的吸光度。1ymol的液体酶，在50°C、pH5. 0的条件下，每小 时水解簇甲基纤维素钢，产生Iymol还原糖（W葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活 力单位扣）。酶活测定结果见图3度）。结果显示了CBHI、EgI、EgII、CBHI-EgI、CBHI+EgII 和CBHI-EgII降解滤纸的比活分别为：1853U/ymol、3372U/ymol、2934U/ymol、5052U/ ymol、5719U/ymol和 14272U/ymol。从结果中可W看出，CBHI-EgI和CBHI-EgII的比活 均较CBHI、EgI和EgII有显著的提高，并且CBHI-EgII的比活是CBHI巧gll的2. 5倍。
[0053] 纤维素酶CMC-Na酶活测定：采用簇甲基纤维素钢（CMC-Na)作为底物进行测定。 取1000 mg簇甲基纤维素钢，用巧樣酸一憐酸氨二钢缓冲液化05M、pH5. 0)定容至50ml， 得到2%的簇甲基纤维素钢溶液。簇甲基纤维素钢溶液应立即使用，使用前适当摇匀。在 4°C下避光保存，有效期为3天。取酶液100y1，加入到IOml巧樣酸一憐酸氨二钢缓冲液 (0.05M、抑5.0)中，得到稀释101倍的酶液。在各试管中加入2%的簇甲基纤维素钢溶液 和巧樣酸一憐酸氨二钢缓冲液（〇.〇5M、pH5.0)各0.45ml，5(TC水浴平衡后，加入已经稀释 的酶液0.1ml(空白先不加），振荡混合均匀。50°C水浴保溫30min，迅速冷却。向各试管中 加入1. 5mlDNS试剂，再向空白中加酶液0. 1ml，混合均匀。在沸水中煮lOmin，迅速冷却。 W0号管为参比，测定540皿的吸光度。1ymol的液体酶，在50°C、pH5. 0的条件下，每小 时水解簇甲基纤维素钢，产生Iymol还原糖（W葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活 力单位扣）。酶活测定结果见图3(0。结果显示了CBHI、EgI、EgII、CBHI-EgI、CBHI+EgII 和CBHI-EgII降解滤纸的比活分别为：4936U/ymol、5379U/ymol、4236U/ymol、11939U/ ymol、10082U/ymol和 18594U/ymol。从结果中可W看出，CBHI-EgI和CBHI-EgII的比 活均较CBHI、EgI和EgII有显著的提高，并且CBHI-EgII的比活是CBHI巧gll的1.8倍。
[0054] 纤维素酶大麦葡聚糖酶活的测定：采用大麦葡聚糖度arleyglucan)作为底物进 行测定。具体方法如下：称取Ig的大麦葡聚糖，用100mL的巧樣酸一憐酸氨二钢缓冲液 (0.05M、pH5.0)溶解，并于沸水中煮2min，确保溶解完全，立即冷却，并定容至100ml，得到 1 %的大麦葡聚糖溶液。将稀释好的100y1酶液加入900yL1 %大麦葡聚糖底物中，对照 组加入100yL灭活的酶液，置于50°C水浴准确保溫lOmin，加入1. 5血DNS终止反应，沸水 煮5min，冷却到室溫后540皿测定OD值。1ymol的液体酶，在50°C、pH5. 0的条件下，每小 时水解簇甲基纤维素钢，产生Iymol还原糖（W葡萄糖计）所需要的酶量定义为一个酶活 力单位扣）。酶活测定结果见图3值）。结果显示了CBHI、EgI、EgII、CBHI-EgI、CBHI+EgII 和CBHI-EgII降解滤纸的比活分别为：：M58U/ymo1、804IU/ymo1、6438U/ymo1、1402抓/ ymol、13674U/ymol和 29783U/ymol。从结果中可W看出，CBHI-EgI和CBHI-EgII的比 活均较CBHI、EgI和EgII有显著的提高，并且CBHI-EgII的比活是CBHI巧gll的2. 2倍。
【主权项】
1. 一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法，其特征在于，所述方法包括在宿 主细胞中融合表达来自里氏木霉的纤维素酶cbhl基因片段和egl基因片段，或纤维素酶 cbhl基因片段和egll基因片段的步骤， 其中，所述纤维素酶cbhl基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，所述egl基因 片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，所述egll基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 1 所示。2. 根据权利要求1所述的获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法，其特征在于， 所述宿主细胞为毕赤酵母、里氏木霉、黑曲霉或米曲霉。3. 表达高活力的里氏木霉融合纤维素酶的重组菌株，其特征在于，所述重组细胞中融 合表达来自里氏木霉的纤维素酶cbhl基因片段和egl基因片段，或纤维素酶cbhl基因片 段和egll基因片段的步骤， 其中，所述纤维素酶cbhl基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，所述egl基因 片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示，所述egll基因片段的核苷酸序列如SEQIDNO. 3 所示。4. 根据权利要求3所述的表达高活力的里氏木霉融合纤维素酶的重组菌株，其特征在 于，所述重组菌株为重组毕赤酵母、重组里氏木霉、重组黑曲霉或重组米曲霉。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种获得高活力的里氏木霉融合纤维素酶的方法及重组菌株。所述方法包括在宿主细胞中融合表达来自里氏木霉的纤维素酶cbhI基因片段和eg1基因片段，或纤维素酶cbhI基因片段和egII基因片段的步骤。表达融合纤维素酶CBHI-EGI和CBHI-EGII的转化子在BMMY培养基中诱导培养2天后，其纤维素酶的滤纸酶活分别为5583U/μmol和8405U/μmol；PASC酶活分别为:5053U/μmol和14272U/μmol；CMC酶活分别为：11939U/μmol和18594U/μmol；大麦葡聚糖的酶活分别为：14023U/μmol和29783U/μmol；其活性均较单独两个酶的协同作用的酶活提高了约1-3倍。
【IPC分类】C12R1/885, C12R1/69, C12N1/19, C12N9/42, C12R1/685, C12R1/84, C12N1/15
【公开号】CN105296451
【申请号】CN201510895568
【发明人】姚斌, 苏小运, 薛鲜丽, 罗会颖, 王亚茹, 王苑, 柏映国, 石鹏君, 黄火清, 马锐
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2016年2月3日
【申请日】2015年12月8日