绿盲蝽唾液蛋白pg2的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域及植物病虫害防治领域，具体地说，涉及绿盲赔唾液蛋 白PG2的应用。
【背景技术】
[0002] 盲赔橡化eteropteraiMiridae)是一类重要的农业害虫，它的寄主植物范围广 泛，已报道有50余科200多种，包括棉花、要、葡萄、楼桃、苹果、茶树等多种重要作物。在 取食过程中，若虫和成虫W针状口器刺吸棉株柔嫩组织中的汁液，并从唾液腺分泌含有唾 液酶的唾液进行体外预消化。另外在盲赔橡唾液中还存在造成棉花出现病理特征的致病 蛋白，所W在盲赔橡危害棉花顶尖，致棉花顶芽干枯死亡，成为无头棉；危害棉花顶尖，致棉 花形成许多不定芽，成为多头棉，表现枝叶丛生；危害棉花叶片后，侵害部位变黑，后形成孔 洞，叶片长大后，孔洞也随之变大，成为很多破洞，称之为破叶疯；幼蕾受到危害后由黄变 黑，形似养麦粒，2-3天后脱落，中型蕾被害后巷叶张开，不久脱落；幼铃受到危害后，轻者 呈现褐色水浸斑，重者满布黑点僵化脱落。
[0003] 盲赔不同于喊虫、粉風等汁液取食者，它主要取食植物细胞的细胞质和细胞核，属 细胞取食者。送类昆虫取食时，先将口针插入植物细胞内或细胞间，然后通过口针的剧烈活 动撕碎植物细胞，同时分泌唾液，将食物源变成泥浆状物质后，再进行吸食。在分泌的唾液 中含有大量唾液酶，其中多聚半乳糖醒酸酶和蛋白酶是主要组成成分。
[0004]Strong和Kruitwagen(1968)曾报道在草盲赔的唾液中存在多聚半乳糖醒酸酶 (polygalac化ronase,PG)活性，并推测有二到H种具有内切、夕['切和水解活性的PGs蛋白 存在，后来研究者证明草盲赔的唾液中至少存在5种PGs蛋白。内切多聚半乳糖醒酸酶 随机降解细胞壁的多聚a-1，4-半乳糖醒酸为低聚半乳糖醒酸，外切多聚半乳糖醒酸酶从 末端降解细胞壁的多聚a-1，4-半乳糖醒酸产生单糖，还有一些PGs同时具有内切和外 切酶活性。到目前为止，在四纹盲赔（PoecilocapsusIinea化S)和美国牧草盲赔（Lygus Lineolaris)唾液中也发现具有外切活性的PGs。同时，研究发现昆虫唾液中的PGs蛋白由 一个高度变异的基因家族控制，它编码一系列的PGs来应对植物体内的PGs抑制剂，通过改 变PGs蛋白的数量和种类来降解植物细胞壁的胶质。通过构建雄性草盲赔若虫的CDNA文 库，获得276个ESTs序列，其中包括3种多聚半乳糖醒酸酶基因片段，通过CDNA末端快速 扩增（RAC巧技术获得送H个基因的全长序列。
[0005] 病理反应是一种普遍存在的现象，推测引起病理反应的致病蛋白种类有多 种类型。早在1970年就在草盲赔的唾液中发现多聚半乳糖醒酸酶的活性，Ecale和 Backus(1995)的研究表明，可能是草盲赔的机械损伤导致植物抗性反应，草盲赔的唾液可 W放大送种反应。草盲赔唾液中的多聚半乳糖醒酸酶能使棉花和紫花首猜的花朵不正常发 育，提取草盲赔唾液蛋白并分离得到具有多聚半乳糖醒酸酶活性的部分，将其注射到植物 幼花基部，会像草盲赔取食植物幼花一样，阻碍花朵发育。后来使用黑曲霉（Aspergillus niger)体外表达重组多聚半乳糖醒酸酶蛋白证明，多聚半乳糖醒酸酶的水解活性导致了首 猜病理性反应。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供绿盲赔唾液蛋白PG2的应用。
[0007] 本发明中涉及的PG2蛋白是由绿盲赔（ApolygusIucorum)唾液腺分泌的一种具 有多聚半乳糖醒酸酶活性的蛋白。PG2蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，或该序列经 替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008]PG2蛋白的编码基因，具体可为如下①~⑨中任一所述的基因；
[0009] ①其核巧酸序列如SeqIDNo.2所示；
[0010] ②在严格条件下与①所示序列杂交且编码与多聚半乳糖醒酸酶合成相关的蛋白 的DNA序列；
[0011] ⑨与①或②所示序列具有90%W上（优选95%W上）的同源性，且编码与多聚半 乳糖醒酸酶的合成相关的蛋白的DNA序列。
[0012] 所述严格条件为在含0. 1 %SDS的0.IXSS阳或含0. 1 %SDS的0.IXSSC溶液中， 在65C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0013] 其中，SeqIDNo. 2所示序列第38-1132bp为编码区，编码SeqIDNo. 1所示的蛋 白。
[0014] 本发明提供绿盲赔唾液蛋白PG2在降解果胶中的应用。
[0015] 本发明还提供绿盲赔唾液蛋白PG2在降解植物细胞壁中的应用。
[0016] 前述应用中，绿盲赔唾液蛋白PG2的制备方法包括W下步骤：
[0017] 1)绿盲赔唾液蛋白PG2基因的克隆；分离绿盲赔唾液腺，提取总RNA，反转录获得 CDNA第一链，WCDNA第一链为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物大小为1095bp;回收 PCR扩增产物连接到pMD-TEasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌畑5a，提取酶切鉴 定正确的阳性克隆的质粒进行测序；
[0018] 2)重组表达载体的构建：将PCR扩增产物插入pPICZaB载体的EcoRI位点，获 得重组表达载体pPICZaB-PG2-His;
[0019] 3)酵母转化及PG2的诱导表达；将pPICZaB-PG2-His转化入毕赤酵母X-33中， 挑取单克隆进行培养，培养过程中加入甲醇诱导表达PG2蛋白，培养结束后，离必收集上 清，用带His标签蛋白纯化柱进行PG2蛋白的纯化。
[0020] 其中，步骤1)中所述引物为：
[0021] F;5' -GAAGCTGCAGGAATTCAATATTTCGAGTTGAAGAATG-3';
[0022] R;5' -CGGCTGGGCCACGTGTCTCTCAGCACAGGGGATTC-3'。
[0023] 本发明还提供含有绿盲赔唾液蛋白PG2的编码基因的载体、宿主细胞、转基因细 胞系和工程菌。
[0024] 本发明进一步提供绿盲赔唾液蛋白PG2或其编码基因在植物抗绿盲赔唾液腺鉴 定技术中的应用。所述植物包括但不限于棉花等。
[00巧]本发明提供由绿盲赔唾液腺分泌的一种具有多聚半乳糖醒酸酶活性的蛋白PG2 的应用。利用真核表达系统（例如酵母细胞）诱导表达的PG2蛋白可降解果胶、植物细胞 壁，解决了难于从绿盲赔体内直接分离获得PG2蛋白的问题。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例4中PG2蛋白活性测定结果；其中，1为阴性对照，2为纯化后 的PG2蛋白。
[0027] 图2(a)-(d)为本发明实施例4中PG2蛋白生物测定结果；其中，图2(a)中1为 注射地后的叶片，图2化)2为注射3d后脱落幼铃，图2 (C)中3为注射3d后脱落幼蕾，图 2(d)中4为注射后3d的叶片。
【具体实施方式】
[0028]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:a1油oratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0029] 实施例1多聚半乳糖醒酸酶编码基因的克隆
[0030] 选取采集自中国农业科学院棉花研究所试验农场棉田的绿盲赔唾液腺，提取总 RNA,总RNA的提取按Promega公司的RNA gents Total RNA Isolation System kit进行。 取5g总RNA反转录获得cDNA第一链，反应体系如下：
[00引]总RNAIOuUSyg)、Oligo