专利名称：非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程和微生物发酵工程技术领域。
背景技术：
骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein，简称BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白，其组织分布具有局限性，分布在矿化组织，包括骨、牙齿和钙化的软骨等，主要由成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞表达和分泌。骨唾液酸蛋白参与组织矿化，与多种骨代谢性疾病有关，近年来又发现BSP与肿瘤的骨转移、动脉粥样硬化及血管增生有关。为了深入研究BSP的生物活性，必须获得稳定的BSP。可从动物或人骨中提取BSP，但来源有限，且提纯的方法繁琐，因此，利用基因工程技术表达重组BSP对于研究BSP的结构与功能有重要意义。
目前在原核表达系统中要表达全长BSP还存在问题，只能得到一些具有空间折叠的未修饰的BSP片段，功能也比天然BSP分子要弱。在真核细胞中已经表达出全长BSP，但除了本申请人，应用酵母表达系统来表达rBSP还未见报道。本申请人曾将人BSP基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，以融合蛋白的形式表达重组BSP。但是，融合蛋白上短肽尾巴的加入可能会改变蛋白的折叠形式，从而影响蛋白的生物活性和功能。其次，由于重组BSP糖基化程度较高，含有大约一半的碳水化合物，难于获取结晶，不适于用X射线衍射和磁共振(NMR)分析其结构。因此，亟需建立能获得BSP非融合表达蛋白的基因工程方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种非融合骨唾液酸蛋白的表达载体，研究结果可为进一步研究BSP的结构和功能以及放大生产奠定基础。
本发明的另一目的在于提供非融合骨唾液酸蛋白的应用。
本发明提供的一种非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体pPICZαA-2×hbsp，通过以下步骤获得1)根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列设计基因特异性引物
上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’以骨唾液酸蛋白(BSP)基因为模板，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建重组质粒pB-hbsp；2)根据毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZaA及hbsp序列设计PCR设计引物上游引物5’-CCG CTCGAG AAA AGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’以重组质粒pB-hbsp为模板进行PCR扩增，PCR产物与毕赤酵母表达载体pPICZaA重组，构建分泌型重组质粒pPICZαA-hbsp，再利用表达载体序列上的一对同尾酶BamH I和Bgl II构建含有BSP基因两个串连的表达盒的质粒pPICZαA-2×hbsp。
本发明提供的非融合骨唾液酸蛋白的制备方法是将表达载体pPICZαA-2×hbsp线性化后电转化毕赤酵母GS115，通过甲醇诱导表达，获得重组人骨唾液酸蛋白。
本发明提供的非融合骨唾液酸蛋白可应用在制备单克隆及多克隆抗体中，为深入研究BSP免疫学和生物学性质和探索其作为药物治疗靶点的可行性奠定基础。
本发明的技术方案细述如下(1)构建BSP的克隆质粒pB-hbsp根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因(hbsp)序列设计基因特异性引物，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建重组质粒pB-hbsp。
(2)骨唾液酸蛋白基因的亚克隆应用PCR技术从pB-hbsp重组质粒获得人BSP基因，上游引物5’-CCGCTCGAG AAA AGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’，下游引物5’-GGGGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’。将其克隆到毕赤酵母表达载体pPICZαA上，获得含人BSP基因的重组质粒pPICZαA-hbsp，并对目的基因进行测序。
(3)多拷贝非融合BSP毕赤酵母表达载体的构建利用表达载体序列上的一对同尾酶BamH I和Bgl II构建含有BSP基因两个串连表达盒的质粒pPICZαA-2×hbsp。
(4)rhBSP毕赤酵母工程细胞的构建将含人BSP基因的毕赤酵母表达载体pPICZαA-2×hbsp电转化毕赤酵母，筛选能表达rhBSP的毕赤酵母转化子，并对转化子进行分析鉴定。
(5)rhBSP的分泌表达及其鉴定将转化子进行摇瓶发酵，诱导表达rhBSP，并对其进行分析和鉴定。
下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步的说明。
图1为重组表达载体pPICZαA-2×hbsp的构建图谱图2为重组载体pPICZαA-2×hbsp的电泳分析(M.λ-Hind III digest DNA分子量标准，0.pPICZαA-hbsp重组质粒，1，2.pPICZαA-2×hbsp重组质粒)图3为重组载体pPICZαA-2×hbsp的酶切鉴定(M.λ-EcoT14 I digest DNA分子量标准，1，2.图2中所对应的1，2两个泳道上的重组质粒Kpn I酶切后的电泳图)具体实施方式
下面列举具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
1.重组载体pB-hbsp的构建与鉴定(1)设计扩增hbsp基因的引物上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’(2)以提取的人股骨外膜组织总RNA为材料，使用Invitrogen公司生产的Superscript One-Step RT-PCR试剂盒，进行RT-PCR扩增第一步，50℃逆转录30min；第二步，94℃变性2min；第三步，进入PCR循环，94℃变性20s，52℃退火30s，72℃延伸1min，重复35个循环；第四步，72℃延伸7min。扩增产物取样电泳，置于-20℃保存备用。EcoR I酶切RT-PCR产物，反应体系总体积20μl，含ddH2O 7μl，10×buffer H 2μl，EcoR I 1μl，DNA 10μl。将目的基因与质粒载体pBluescript II RI(Stratagene公司产品)同时进行琼脂糖凝胶电泳，大致判断二者的质量比及物质的量比，按目的基因与载体之间物质的量比3∶1比例混合，进行连接反应，反应体系总体积20μl，含T4DNA连接酶1μl，16℃水浴12～16h。重组子转化E.coli-CDH(Invitrogen公司产品)感受态细胞，从转化板上随机挑几个转化子菌落，接种到3ml LB液体培养基中扩增，小量提质粒进行电泳和酶切鉴定重组子。以Sph I和Hind III双酶切重组质粒，进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。正向连接产物经双酶切后得到819bp的片段，为pB-hbsp目的质粒，而反向连接产物只能切下209bp的小片段。
2.酵母表达载体pPICZαA-hbsp的构建与鉴定(1)以pB-hbsp克隆质粒为模板，进行人BSP基因的PCR扩增。
设计的引物序列如下上游引物5’-CCG CTCGAG AAA AGA TTC TCAATG AAAAAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’总反应体积50μl，包括PCR缓冲液(含Mg2+)5μl，上游引物2.5μl，下游引物2.5μl，dNTP 2μl(终浓度为100μmol/L)，扩增模板3μl(约60pg)，ddH2O 34μl，Taq DNA聚合酶1.0μl。PCR反应程序94℃变性5min，循环开始时，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，30个循环之后72℃延伸5min，最后冷至4℃。
(2)PCR产物的纯化 采用酚氯仿抽提和乙醇沉淀的方法。
(3)纯化后的PCR产物双酶切 先用KpnI单酶切，并对KpnI单酶切后的产物进行纯化除盐，再用XhoI单酶切纯化后的产物。经过连续两次酶切后的产物采用凝胶回收的方法进行回收。
(4)表达载体pPICZαA的双酶切及其纯化 方法同上。
(5)体外连接 反应体系总体积25μl，包括目的基因7.5μl，载体片断5.5μl，10×T4DNA连接酶buffer 2.5μl，T4 DNA连接酶1μl，ddH2O 8.5μl。体系中目的基因与载体之间摩尔比约为8∶1。16℃水浴16h。
(6)大肠杆菌的转化 取-70℃保存的感受态细胞200μl，冰浴中解冻。加入15μl连接产物，轻轻旋转以混匀内容物，在冰上放置30min。将管放入预加温至42℃的水浴中，放置90s。冰浴冷却1-2min。加入800μl不含Zeocin的低盐LB培养基。用水浴将培养基加温至37℃，然后将管转移到摇床上，100r/min温育45min。取200μl已转化的感受态细胞到含有25g/ml Zeocin的低盐LB固体培养基上。将平板置于室温直至液体被吸收。倒置平板，于37℃培养12-16h。从Zeocin(25μg/ml)抗性筛选平板上随机挑取4个较大的菌落接种至2ml的低盐LB液体培养基中扩增，提取质粒。
(7)电泳与酶切鉴定 以pPICZαA质粒作为对照、与重组的pPICZαA-hbsp质粒一起进行琼脂糖凝胶电泳，然后将重组pPICZαA-hbsp质粒分别用XhoI、KpnI酶切鉴定。
(8)测序 将重组质粒pPICZαA-hbsp交由大连宝生物工程公司测序，发现与Genebank登陆号NM_004967上的序列比较有99.4％的同源性，而不同的碱基引起的氨基酸改变不在已知的蛋白质活性区域，也不属于糖基化位点，鉴于可能有测序误差，认为重组表达载体pPICZαA-hbsp的构建成功。
3.含人BSP基因串联表达盒的pPICZαA-2×hbsp表达载体的构建与鉴定(1)表达盒片断的获得用BamH I对重组pPICZαA-hbsp质粒单酶切，再用Bgl II单酶切纯化后的产物，将酶切后的反应体系中的溶液进行电泳，电泳的结果会出现一大一小的两片断，长度分别为1917bp和2537bp。用切胶回收的方法对长度为2537bp的表达盒片断进行纯化。
(2)载体片断的获得用BamH I单酶切重组载体pPICZαA-hbsp，得到长度为4454bp的大片断，用切胶回收的方法进行纯化(3)载体片断的去磷酸化用来源于小牛肠(Calf intestine)的碱性磷酸酶(CIAP)对纯化后的载体片断进行去磷酸化处理。去磷酸化反应体系为无菌ddH2O 26μl，10×CIAP buffer 5μl，CIAP(25U/μl)4μl，底物15μl，总反应体积50μl。50℃反应30min。反应结束后用酚氯仿抽提1次，然后乙醇沉淀。
(4)体外连接目的片断10μl，载体片断3.5μl，10×T4DNA连接酶buffer 2.5μl，T4 DNA连接酶1μl，ddH2O 3μl，总体积20μl。16℃水浴16h。
(5)大肠杆菌的转化、重组质粒的提取、电泳及酶切鉴定以pPICZαA质粒做对照、pPICZαA-hbsp以及pPICZαA-2×hbsp一起进行琼脂糖凝胶电泳，然后将重组pPICZαA-2×hbsp质粒用KpnI酶切鉴定，结果见图2。
4.重组人骨唾液酸蛋白毕赤酵母工程细胞的构建及表达鉴定(1)重组质粒电转化毕赤酵母GS115以Sac I酶切，使pPICZαA和pPICZαA-2×hbsp质粒线性化。制备毕赤酵母GS115感受态细胞，电转化，设定电脉冲条件电压1500V，电阻200Ω，电容25μF。
(2)转化子表型的PCR鉴定上游引物(5′AOX1引物)5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′下游引物(3′AOX1引物)5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′分别提取GS115、GS115/pPICZαA、GS115/pPICZαA-2×hbsp三种酵母基因组作为PCR分析的模板。产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定。
(3)rhBSP的诱导表达、SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定 将GS115/pPICZαA作为对照菌，从抗性平板上挑取经过PCR鉴定过的单菌落转化子接种到含有25ml的BMGY培养基的250ml摇瓶中。30℃300r/min下振荡培养直到OD600达到2-6。离心，室温3000g×5min，收集细胞，弃上清，将细胞沉淀重悬于100ml的BMMY培养基中，30℃300r/min下振荡培养，诱导蛋白表达。每隔24h在摇瓶中加入100％甲醇至终浓度为1％。96h后，3000g室温离心5min收集上清。对上清进行超滤浓缩，超滤膜为PM10(截留分子量≥10KDa的蛋白)，工作压强为0.35Mpa，泵转速为60r/min。将浓缩好的样品马上进行SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定，或置-80℃贮存。
结果重组表达载体pPICZαA-2×hbsp浓缩至较高浓度后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞，在Zeocin平板上筛选出有抗性的转化子。表达rhBSP的毕赤酵母工程细胞经过PCR鉴定，表明表达载体已整合至宿主染色体上。发酵液中目的蛋白的分子量介于43KDa与66.2Kda之间。
权利要求
1.一种非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体pPICZαA-2×hbsp，其特征在于是通过以下步骤获得的1)根据GenBank中人骨唾液酸蛋白基因hbsp序列设计基因特异性引物上游引物5’-AGGAATTCGACTGCCAGAGGAAGCAATCAC-3’下游引物5’-CGGAATTCACTGGTGGTGGTAGTAATTCTG-3’以骨唾液酸蛋白BSP基因为模板，应用RT-PCR技术从人股骨外膜组织的总RNA中扩增出BSP的cDNA，克隆至pBluescript II RI质粒中，构建重组质粒pB-hbsp；2)根据毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZaA及hbsp序列设计PCR设计引物上游引物5’-CCG CTCGAGAAAAGA TTC TCA ATG AAA AAT TTG-3’下游引物5’-GG GGTACC TCA CTG GTG GTG GTA GTA ATT CTG-3’以重组质粒pB-hbsp为模板进行PCR扩增，PCR产物与毕赤酵母表达载体pPICZaA重组，构建分泌型重组质粒pPICZαA-hbsp，再利用表达载体序列上的一对同尾酶BamH I和Bgl II构建含有BSP基因两个串连的表达盒的质粒pPICZαA-2×hbsp。
2.权利要求1所述的非融合骨唾液酸蛋白的制备方法，其特征在于将表达载体pPICZαA-2×hbsp线性化后电转化毕赤酵母GS115，通过甲醇诱导表达，获得重组人骨唾液酸蛋白。
3.权利要求1所述的非融合骨唾液酸蛋白在制备单克隆及多克隆抗体中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种非融合骨唾液酸蛋白的酵母表达载体及其应用，属于基因工程和微生物发酵工程技术领域。本发明在构建的含人BSP全长cDNA的pB－hbsp质粒基础上，由人BSP基因的扩增、含有串联的两个表达盒的重组酵母表达载体pPICZαA－2×hBSP的构建与鉴定、重组酵母表达载体转化毕赤酵母GS115、GS115/pPICZαA－2×hBSP工程菌的甲醇诱导表达和目的蛋白的鉴定等步骤组成。本发明首次成功构建串联的非融合的重组人骨唾液酸蛋白基因(rhBSP)表达盒并在毕赤酵母GS115成功进行rhBSP的表达，为rhBSP的制备提供了一条简捷途径。
文档编号C12N1/19GK101063147SQ20071002779
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月28日 优先权日2007年4月28日
发明者王捷, 夏冰 申请人:王捷, 夏冰