绿盲蝽唾液蛋白pg20的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域及植物病虫害防治领域，具体地说，涉及绿盲蝽唾液蛋 白PG20的应用。
【背景技术】
[0002] 盲蝽蟓（Heteroptera:Miridae)是一类重要的农业害虫，它的寄主植物范围广 泛，已报道有50余科200多种，包括棉花、率、葡萄、樱桃、苹果、茶树等多种重要作物。在 取食过程中，若虫和成虫以针状口器刺吸棉株柔嫩组织中的汁液，并从唾液腺分泌含有唾 液酶的唾液进行体外预消化。另外在盲蝽蟓唾液中还存在造成棉花出现病理特征的致病 蛋白，所以在盲蝽蟓危害棉花顶尖，致棉花顶芽干枯死亡，成为无头棉；危害棉花顶尖，致棉 花形成许多不定芽，成为多头棉，表现枝叶丛生；危害棉花叶片后，侵害部位变黑，后形成孔 洞，叶片长大后，孔洞也随之变大，成为很多破洞，称之为破叶疯；幼蕾受到危害后由黄变 黑，形似荞麦粒，2-3天后脱落，中型蕾被害后苞叶张开，不久脱落；幼铃受到危害后，轻者 呈现褐色水浸斑，重者满布黑点僵化脱落。
[0003] 盲蝽不同于蚜虫、粉虱等汁液取食者，它主要取食植物细胞的细胞质和细胞核，属 细胞取食者。这类昆虫取食时，先将口针插入植物细胞内或细胞间，然后通过口针的剧烈活 动撕碎植物细胞，同时分泌唾液，将食物源变成泥浆状物质后，再进行吸食。在分泌的唾液 中含有大量唾液酶，其中多聚半乳糖醛酸酶和蛋白酶是主要组成成分。
[0004] Strong和Kruitwagen(1968)曾报道在草盲蝽的唾液中存在多聚半乳糖酸酸酶 (polygalacturonase,PG)活性，并推测有二到三种具有内切、外切和水解活性的PGs蛋白 存在，后来研究者证明草盲蝽的唾液中至少存在5种PGs蛋白。内切多聚半乳糖醛酸酶随 机降解细胞壁的多聚ct-1，4-半乳糖醛酸为低聚半乳糖醛酸，外切多聚半乳糖醛酸酶从 末端降解细胞壁的多聚ct-1，4-半乳糖醛酸产生单糖，还有一些PGs同时具有内切和外 切酶活性。到目前为止，在四纹盲蝽（Poecilocapsuslineatus)和美国牧草盲蝽（Lygus Lineolaris)唾液中也发现具有外切活性的PGs。同时，研究发现昆虫唾液中的PGs蛋白由 一个高度变异的基因家族控制，它编码一系列的PGs来应对植物体内的PGs抑制剂，通过改 变PGs蛋白的数量和种类来降解植物细胞壁的胶质。通过构建雄性草盲蝽若虫的cDNA文 库，获得276个ESTs序列，其中包括3种多聚半乳糖醛酸酶基因片段，通过cDNA末端快速 扩增（RACE)技术获得这三个基因的全长序列。
[0005] 病理反应是一种普遍存在的现象，推测引起病理反应的致病蛋白种类有多 种类型。早在1970年就在草盲蝽的唾液中发现多聚半乳糖醛酸酶的活性，Ecale和 Backus(1995)的研究表明，可能是草盲蝽的机械损伤导致植物抗性反应，草盲蝽的唾液可 以放大这种反应。草盲蝽唾液中的多聚半乳糖醛酸酶能使棉花和紫花苜蓿的花朵不正常发 育，提取草盲蝽唾液蛋白并分离得到具有多聚半乳糖醛酸酶活性的部分，将其注射到植物 幼花基部，会像草盲蝽取食植物幼花一样，阻碍花朵发育。后来使用黑曲霉（Aspergillus niger)体外表达重组多聚半乳糖醛酸酶蛋白证明，多聚半乳糖醛酸酶的水解活性导致了苜 蓿病理性反应。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供绿盲蝽唾液蛋白PG20的应用。
[0007] 本发明中涉及的PG20蛋白是由绿盲蝽（Apolyguslucorum)唾液腺分泌的一种具 有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白。PG20蛋白的氨基酸序列如SEQIDNo. 1所示，或该序列 经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0008] PG20蛋白的编码基因，具体可为如下①~③中任一所述的基因；
[0009] ①其核苷酸序列如SeqIDNo. 2所示；
[0010] ②在严格条件下与①所示序列杂交且编码与多聚半乳糖醛酸酶合成相关的蛋白 的DNA序列；
[0011] ③与①或②所示序列具有90%以上（优选95%以上）的同源性，且编码与多聚半 乳糖醛酸酶的合成相关的蛋白的DNA序列。
[0012] 所述严格条件为在含0· 1 %SDS的0· 1XSSPE或含0· 1 %SDS的0· 1XSSC溶液 中，在65 °C下杂交，并用该溶液洗膜。
[0013] 其中，SeqIDNo. 2所示序列第46_1083bp为编码区，编码SeqIDNo. 1所示的蛋 白。
[0014] 本发明提供绿盲蝽唾液蛋白PG20在降解果胶中的应用。
[0015] 本发明还提供绿盲蝽唾液蛋白PG20在降解植物细胞壁中的应用。
[0016] 前述应用中，绿盲蝽唾液蛋白PG20的制备方法包括以下步骤：
[0017] 1)绿盲蝽唾液蛋白PG20基因的克隆：分离绿盲蝽唾液腺，提取总RNA，反转录获得 cDNA第一链，以cDNA第一链为模板，设计引物进行PCR扩增，扩增产物大小为1062bp;回收 PCR扩增产物连接到pMD-TEasy载体上，构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α，提取酶切鉴 定正确的阳性克隆的质粒进行测序；
[0018] 2)重组表达载体的构建：将PCR扩增产物插入pPICZαΒ载体的EcoRI位点，获 得重组表达载体pPICZaB-PG20-His;
[0019] 3)酵母转化及PG20的诱导表达：将pPICZaB-PG20_His转化入毕赤酵母X-33 中，挑取单克隆进行培养，培养过程中加入甲醇诱导表达PG20蛋白，培养结束后，离心收集 上清，用带His标签蛋白纯化柱进行PG20蛋白的纯化。
[0020] 其中，步骤1)中所述引物为：
[0021] F：5/ -GAAGCTGCAGGAATTATGATTTCCCTAGGCCTCCTCGTGA-3/ ；
[0022] Rj' -CGGCTGGGCCACGTGTTTGACACCTGGGGGAACTC-3，。
[0023] 本发明还提供含有绿盲蝽唾液蛋白PG20的编码基因的载体、宿主细胞、转基因细 胞系和工程菌。
[0024] 本发明进一步提供绿盲蝽唾液蛋白PG20或其编码基因在植物抗绿盲蝽唾液腺鉴 定技术中的应用。所述植物包括但不限于棉花等。
[0025] 本发明提供由绿盲蝽唾液腺分泌的一种具有多聚半乳糖醛酸酶活性的蛋白PG20 的应用。利用真核表达系统（例如酵母细胞）诱导表达的PG20蛋白可降解果胶、植物细胞 壁，解决了难于从绿盲蝽体内直接分离获得PG20蛋白的问题。
【附图说明】
[0026] 图1为本发明实施例4中PG20蛋白活性测定结果；其中，1为阴性对照，2为纯化 后的PG20蛋白。
[0027] 图2为本发明实施例4中PG20蛋白生物测定结果；其中，1为注射4h后的叶片，2 为注射3d后脱洛幼铃，3为注射3d后脱洛幼雷，4为注射后3d的叶片。
【具体实施方式】
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实 施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0029] 实施例1多聚半乳糖醛酸酶编码基因的克隆
[0030] 选取采集自中国农业科学院棉花研究所试验农场棉田的绿盲蝽唾液腺，提取总 RNA，总RNA的提取按Promega公司的RNAgentsTotalRNAIsolationSystemkit进行。 取5g总RNA反转录获得cDNA第一链，反应体系如下：
[0031] 总RNA10yL(5yg)、Oligo(dT) (20ymol/L)1.5yL、10X