或3个） 氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肤。送些保守性变异多肤最好根据表1 进行氨基酸替换而产生。
[0043] 表 1
[0044]
[0045]
[0046] 本发明还提供了编码本发明褐藻胶裂解酶或其保守性变异多肤的多核巧酸序列。
[0047] 本发明的多核巧酸可W是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA 或人工合成的DNA。DNA可W是单链的或是双链的。DNA可W是编码链或非编码链。编码成 熟多肤的编码区序列可W与SEQIDNO: 1所示的编码区序列相同或者是简并的变异体。如 本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQIDN0:2的蛋白质，但与SEQID NO: 1所示的编码区序列有差别的核酸序列。
[0048] 编码SEQIDNO:2的成熟多肤的多核巧酸包括：只编码成熟多肤的编码序列；成 熟多肤的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肤的编码序列（和任选的附加编码序列） W及非编码序列。
[0049] 术语"编码多肤的多核巧酸"可W是包括编码此多肤的多核巧酸，也可W是还包括 附加编码和/或非编码序列的多核巧酸。
[0050] 本发明还涉及上述多核巧酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多 肤或多肤的片段、类似物和衍生物。此多核巧酸的变异体可W是天然发生的等位变异体或 非天然发生的变异体。送些核巧酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核巧酸的替换形式，它可能是一个或多个核巧酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肤的功能。
[0051] 本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少80% (如85%，90%， 95%，99%)相同性的多核巧酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核巧酸可 杂交的多核巧酸。在本发明中，"严格条件"是指：（1)在较低离子强度和较高温度下的杂 交和洗脱，如0. 2XSSC，0. 1%SDS，6(TC;或（2)杂交时加有变性剂，如50% (v/v)甲醜胺， 0. 1%小牛血清/0. 1%Ficoll,42°C等；或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%W 上，更好是95%W上时才发生杂交。并且，可杂交的多核巧酸编码的多肤与SEQIDN0:2所 示的成熟多肤有相同的生物学功能和活性。
[0052] 本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。如本文所用，"核酸片段"的长度至 少含15个核巧酸，较好是至少30个核巧酸，更好是至少50个核巧酸，最好是至少100个核 巧酸W上。核酸片段可用于核酸的扩增技术（如PCR)W确定和/或分离编码褐藻胶裂解 酶的多聚核巧酸。
[0053] 本发明的褐藻胶裂解酶核巧酸全长序列或其片段通常可W用PCR扩增法、重组法 或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核巧酸序列，尤其是 开放阅读框序列来设计引物，并用市售的CDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所 制备的CDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR 扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。
[0054] -旦获得了有关的序列，就可W用重组法来大批量地获得有关序列。送通常是将 其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。 [00巧]此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通 过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。
[0056] 本发明也涉及包含本发明的多核巧酸的载体，W及用本发明的载体或褐藻胶裂解 酶编码序列经基因工程产生的宿主细胞，W及经重组技术产生本发明所述多肤的方法。
[0057] 通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多聚核巧酸序列来表达或生产重组的 褐藻胶裂解酶。一般来说有W下步骤：
[0058](I).用本发明的编码褐藻胶裂解酶的多核巧酸（或变异体），或用含有该多核巧 酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
[0059] (2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；
[0060] (3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。
[0061] 本发明中，褐藻胶裂解酶多核巧酸序列可插入到重组表达载体中。术语"重组表达 载体"指本领域熟知的细菌质粒、瞻菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其 他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可W用。表达载体的一个 重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。
[0062] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含褐藻胶裂解酶编码DNA序列和合适 的转录/翻译控制信号的表达载体。送些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内 重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，W指导mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
[0063] 此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，W提供用于选择转化的 宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氨叶酸还原酶、新霉素抗性W及绿色英光蛋 白（GFP)，或用于大肠杆菌的卡郝霉素或氨予青霉素抗性。
[0064] 包含上述的适当DNA序列W及适当启动子或者控制序列的载体，可W用于转化适 当的宿主细胞，W使其能够表达蛋白质。
[0065] 宿主细胞可W是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高 等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母； 植物细胞等。
[0066] 在本发明的优选实施例中，将本发明的褐藻胶裂解酶基因algp用于制备大肠杆 菌表达载体pet28-algp，进而制备获得大肠杆菌重组株SW值E3)。本发明制备的大肠杆菌 重组表达菌株SW〇)E3)表达水平高，能稳定分泌至胞外上清中，更利于纯化。且多次传代后 表达量未有降低。因此，送是一株较为理想的高产菌株。
[0067] 如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重 组的蛋白。送些方法是本领域技术人员所熟知的。送些方法的例子包括但并不限于：常规 的复性处理、用蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离必、渗透破菌、超处理、超离必、分子筛层析 (凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC)和其它各种液相层析技术及 送些方法的结合。
[0068] 本发明提供的来源于海洋弧菌（VibrioSP. )QY102的褐藻胶裂解酶是首次被掲示 的。本发明基于新发现的褐藻胶裂解酶提供的表达系统和表达方法，用其生产的褐藻胶裂 解酶稳定性好，活性高。
[0069] 本发明的大肠杆菌重组菌株SW〇)E3)所表达的重组褐藻胶裂解酶表达水平高，能 稳定分泌至胞外上清中，更利于纯化。且多次传代后表达量未有降低，所W通过本发明可W W较低的成本大量生产重组褐藻胶裂解酶。
[0070] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，送些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第H版，科学出版社，2002中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。
[0071] 实施列1、褐藻胶裂解酶基因algp部分序列的克隆
[0072] 使用简并引物W海洋弧菌（VibrioSP.)QY102的基因组为模板进行聚合酶链 反应（PCR)克隆褐藻胶裂解酶基因algp,具体操作为；在LB培养基中过夜培养Vibrio SP.QY102,使用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DM。使用如下简并引物（其中，N=A 或C或G或T，R=A或G，Y=C或T，B=C或G或T):
[0073]Pl;5, -CGNTCNGARCTNCGNGARATG-3'（沈QIDN0:3)，
[0074]p2 ;5' -YTGRTTRTABACBCCBGCYTT-3'（沈QIDN0:4);
[0075] 进行梯度PCR反应，条件为；95°C预变性5min，随后95°C30s、45°C-65°C30s、 72°CImin进行30个循环，最后在72°C延伸lOmin。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后在55化P 左右有一明亮的特异性条带。将该条带切下，经琼脂糖凝胶电泳回收后连接PMD19-T载体 灯akara)中后采用标准的氯化巧法转入大肠杆菌toplO菌株中，涂布于含有硫酸卡郝霉素 抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液体培养基（含硫酸卡郝霉素）中培养，使 用通用引物M13进行PCR验证，正确后将阳性转化子送去测序。通过生物信息学分析该质 粒所含的片段确为褐藻胶裂解酶基因的部分序列。
[0076] 将该阳性转化子命名为pMD19-T-al甜p/ToplO,将其含有的质粒命名为 pMD19-T-al甜P。
[0077] 实施列2、褐藻胶裂解酶基因al甜全长的克隆
[0078] 根据得到的褐藻胶裂解酶algp的部分序列设计染色体步移引物，获取下游片段 的引物分别为：
[0086] 根据化kara公司的染色体步移试剂盒说明书对获取上下游片段分别进行3轮PCR 反应，经凝胶电泳后获得褐藻胶裂解酶基因algp的部分序列的上游片段约ISOObp,下游 片段约2500bp。将2个片段分别连接PMD19-T载体后采用标准的氯化巧法转入大肠杆菌 ToplO菌株中，涂布于含有硫酸卡郝霉素抗性的LB平板上，过夜培养后挑取单克隆在LB液 体培养