一种三七转录因子基因PnERF1及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及分子生物学以及基因工程领域，尤其是一种三七皂苷生物合成相关转录因子基因PnERFI及应用。
【背景技术】
[〇〇〇2] 三七Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen为五加科人参属植物，根和根莖入药，是云南的道地药材。三七作为传统中药已有悠久的应用历史，清代药学著作《本草纲目拾遗》中记载“人参补气第一，三七补血第一，味同而功亦等，故称人参三七，为中药之最珍贵者”。三七具有活血和止血的双重功效，是驰名中外的“云南白药”的重要成分。三七主产于我国云南省文山州，均为人工栽培品，全世界98%的三七原药材产于云南，三七已经成为云南省最重要的药材资源。
[〇〇〇3] 三七阜苷(saponins of Panax notoginseng, PNS)是三七的主要药用成分，由多种四环三萜皂苷组成。目前，已从三七的根块、根茎(剪口)、茎、叶和花等部位分离和鉴定出70余种达玛烷型四环三萜皂苷，如人参皂苷Rbl、Rgl、Rhl、Rd、Re和F1等，这些单体皂苷大多数为达玛烷20(S)_原人参二醇型[20(S)-protopanaxad1l]和20(S)_原人参三醇型[20(S)-protopanaxatr1l]，未发现含有齐墩果酸型阜苷，这与人参和西洋参有显著差异。三七皂苷具有扩张冠状动脉和外周血管、增加脑血流量的作用;还有抑制血小板凝聚、降低血液粘稠度、抑制血栓形成的功效；同时，兼具降血脂、抗疲劳、耐缺氧，提高和增强巨噬细胞功能等作用。
[0004]三七为多年生草本植物，一般需生长3-7年方能入药，故名“三七”。三七对生境要求苛刻，适合种植三七的土地面积有限；同时，三七生长过程中病虫害严重，土壤次生盐渍化和酸化突出，导致三七种植需要“轮作”。这种生长周期长，土地利用率低下的现状，制约了三七产业的可持续发展。近些年，以三七为组分的药品市场迅速扩大，导致三七药材需求增长，供需矛盾突出。鉴于人工栽培时间长，化学合成机理和路线不够清晰等弊端，利用生物工程技术和基因调控的方法来生产三七皂苷逐渐成为研究热点。
[0005]茉莉酸甲酯(MeJA)是植物重要次级代谢信号分子，在植物抗逆自我保护过程中扮演重要角色，能够引起细胞次生代谢物的合成。目前，有关茉莉酸甲酯介导的植物次生代谢合成过程已经从研究重要基因的表达逐步过渡到相关转录因子的研究。越来越多的证据表明，控制重要萜类次生代谢物合成的转录因子大多能被茉莉酸甲酯诱导表达。
[0006]转录因子对基因的转录激活是植物次生代谢过程重要的调控环节。利用转录因子作为改造植物代谢途径的工具，以其独有的“多点调控”优势，弥补了代谢工程操作中单个关键酶基因作用不足和多个关键酶基因可能产生组成性致死表达的情况，成为一种新的策略。次生代谢途径中多个功能相关的酶基因常被同一转录因子正调控或负调控，对转录因子进行基因修饰显然比多基因操作更容易改良目标次生代谢途径。
[0007]AP2/ERF(APETALA2/ETHYLENE Responsive Factor)转录因子是植物所特有的一类转录因子，越来越多的研究表明该类转录因子对真核生物的次生代谢过程具有重要调控作用。例如长春花(Catharanthus roseus)AP2/ERF类转录因子0RCA3可调控参与砲类Π引噪生物碱生物合成的异胡豆苷合成酶基因的表达；青蒿(Artemisiaapiacea)AaERFl和AaERF2转录因子可以提高青蒿素生物合成相关的紫穗槐4,11-二烯合酶(ADS)和细胞色素P450单加氧酶(CYP71AV1)基因的表达量，正调控青蒿素的合成；此外，红豆杉(Taxuschinensis) TcAP2转录因子可调控紫杉醇生物合成关键酶基因的表达。
[0008]随着对植物次生代谢网络的深入解析和调控机制的阐明，特别是调节特定次生代谢物合成的转录因子的分离和鉴定，基于转录因子的基因工程将为开发利用植物次生代谢物提供更加有效的手段。本发明以体外培养的三七愈伤组织为研究对象，克隆PnERFl转录因子基因，并对该转录因子进行分析和功能鉴定，明确PnERFl转录因子在三七皂苷生物合成过程中的地位和作用，为获得高效、稳定的三七皂苷合成调控技术和同源或异源高效表达系统的建立提供理论参考和依据。
【发明内容】
[0009]本发明的目的是从三七中克隆获得可调控三七皂苷生物合成的转录因子基因PnERFl以及明确该转录因子的应用，即在提高三七皂苷合成代谢途径中关键酶基因表达量和增加三七愈伤组织中总皂苷与单体皂苷含量的应用。
[〇〇1〇]本发明根据基因的保守结构域和cDNA末端快速扩增技术从三七中克隆到AP2/ERF类转录因子基因并对其编码蛋白进行功能鉴定。发明人将这个基因命名为PnERFl，其中所述的cDNA全长如SEQ ID N0:1所示。对该基因进行序列分析，表明PnERFl全长cDNA大小为1113 bp，PnERFl编码区是序列表SEQ ID N0:1中第127-927位所示的核苷酸序列，具有801bp的开放阅读框(Open reading frame, ORF)、126 bp的5’非翻译区和186 bp的3’非翻译区，编码含有266个氨基酸的蛋白质，氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。利用植物表达载体，通过农杆菌介导法将本发明的PnERFl转录因子基因导入三七愈伤组织中，可提高三七皂苷合成途径关键酶基因的表达量，使三七皂苷的产量增加。
[〇〇11] 上述转录因子基因可应用于正调控三七皂苷的生物合成，具体操作如下:
(1)基因全长cDNA的获得:首先根据长春花0RCA基因家族的保守结构域设计简并引物，扩增出AP2/ERF类转录因子基因的5’核心序列，再利用DNA末端快速扩增技术(3’RACE)获得PnERFl的全长cDNA，设计引物扩增PnERFl的0RF框，然后将其连接到pGEM-T easy载体上，经测序验证获得具有目的基因的克隆；
(2)植物表达载体构建与遗传转化:用限制性内切酶Xbal和Smal酶切pGEM-T-PnERFl质粒，通过胶回收获得目的基因片段;用同样的内切酶消化植物表达载体PCAMBIA2300S，胶回收获得载体大片段。将目的基因片段与PCAMBIA2300S载体片段连接，构建植物超表达载体pCAMBIA2300S-PnERFl;通过液氮冻融法将pCAMBIA2300S-PnERFl质粒导入农杆菌菌株EHA105中，利用农杆菌介导的遗传转化法，将PnERFl导入三七愈伤组织中使其过量表达。通过抗生素筛选和qRT-PCR筛选阳性转基因细胞系；
(3)转基因细胞系总皂苷含量检测:提取三七非转基因和转基因细胞系中的皂苷，分析非转基因和转基因细胞系间总皂苷含量的差异；
(4)转基因细胞系部分重要单体皂苷含量检测:制备三七非转基因和总皂苷含量得到提高的转基因细胞系的皂苷溶液，利用HPLC法对非转基因和转基因细胞系中的部分重要单体皂苷含量进行测定，分析非转基因和转基因细胞系间单体皂苷含量的差异。
[0012]本发明为提高三七中皂苷的含量提供了一种新方法，利用生物工程技术和基因调控的方法可更高效率合成三七皂苷，克服了人工栽培周期长、化学合成机理和路线不够清晰等缺点。将转录因子PnERFl基因导入三七细胞中表达，使三七皂苷生物合成途径关键酶基因的表达量提高，增加了三七皂苷的产量，为大规模产业化生产三七皂苷提供了理论参考和科学依据。
【附图说明】
[0〇13]图1为本发明中三七总RNA电泳图谱；
图2为本发明中纯化mRNA电泳图谱，其中Μ为DL2000 DNA Marker，l为纯化的mRNA;
图3为本发明中PnERFl全长cDNA扩增结果；其中Μ为DL2000 DNA Marker，l为PnERFl全长cDNA扩增产物；
图4为本发明中PnERFl的三维结构预测；
图5为本发明中PnERFl基因0RF框扩增结果，其中Μ为DL2000 DNA Marker，l为PnERFl0RF框扩增产物；
图6为本发明中qRT-PCR结果分析图，表示三七皂苷合成途径中受PnERFl调控的FPS、HMGR和SE基因在野生型和转基因细胞系中的表达水平，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系；
图7为本发明中三七总皂苷含量测定结果，其中C为野生型细胞