系，1-3为转基因细胞系；
图8为本发明三七细胞中部分重要单体皂苷含量测定结果，其中C为野生型细胞系，1-3为转基因细胞系。
【具体实施方式】
[0014]下面通过附图和实施例对本发明进一步说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0〇15]实施例1: PnERFl基因的克隆以及生物信息学分析首先根据长春花0RCA基因家族的保守结构域设计简并引物，从三七中扩增出PnERFl转录因子基因的5’核心序列。采用改良的异硫氰酸胍法提取经茉莉酸甲酯处理3-6 h的三七细胞总RNA(图1)，参照NucleoTeap? mRNA (MACHERGY-NAGEL)试剂盒进行mRNA的分离(图2)，再利用SMARTer? RACE Cdna Amplificat1n试剂盒制备RACE-Ready cDNA。以合成的3’ -RACE-Ready cDNA文库为模板，通过使用cDNA末端快速扩增技术(3’RACE)得到了PnERFl基因的3’片段，其引物为5’-CAGCGTCCATGGGGGAAATTCGCGGCGG-3’ ；再根据PnERFl基因的5’和3 ’末端序列设计引物，用于扩增PnERFl基因的cDNA全长，分别为？1^1^1「:5’-CATGGGGTCTCATCAAAAACAAATC-3’；PnERFlR:5’- GATTTGATAAGTTG TTCCCCTAAGC-3’；PCR反应条件:94°C，5 min;94°C，30 s;54°C，30 s;72°C，70 s，32个循环；72°C，10 min。将PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶分离(图3)、胶回收并连接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆摇菌，菌液PCR检测后送测序。
[0016]最终获得的PnERFl全长cDNA大小为 1113 bp，通过NCBI ORF finder (http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)分析发现其包含一个801 bp的ORF(见序列表)。PnERFl编码蛋白的分子量约为30.1 KD，等电点为6.09，不稳定系数为44.07，预测PnERFl编码的蛋白质不稳定。生物信息学预测PnERFl不包含跨膜区，不含信号肽，具有一个由64个氨基酸组成的AP2/ERF转录因子特征保守结构域。借助SWISS-MODEL对PnERFl进行三维结构预测分析(图4)，结果表明，PnERFl有三个反向平行的β-折叠和一个α-螺旋，且在71-136位氨基酸处的结构与拟南芥AtERFl转录因子晶体结构的相似率达71.93%，这进一步说明PnERFl属于AP2/ERF类转录因子。
[0017]实施例2:植物表达载体构建根据PnERFl基因0RF框的5 ’和3 ’末端序列设计引物，用于扩增PnERFl基因的0RF，分别为上游引物:5 ’ - TCTAGAGTGCTCTTTAAACGACATCGTCGAA-3 ’ ；下游引物:5 ’ -GGGCCCATGTGTGGAGGTGCAATCCTAGGTG-S’JCR反应条件:94°C，5 min;94°C，30 s;58 °C，30s;72 °C，50 s，32个循环;72 °C，10 min。将PCR产物用1.2%的琼脂糖凝胶分离(图5)、胶回收并连接到pGEM T-easy载体上，转化大肠杆菌感受态，挑单克隆摇菌，菌液PCR检测后送测序。
[0018]采用SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒(上海生工)提取经测序正确的大肠杆菌质粒pGEM-T-PnERFl以及植物表达载体pCAMBIA2300S的质粒，取1 yL用于琼脂糖凝胶电泳以检测所提取质粒的完整性和浓度高低。用Xbal (TaKaRa)和Smal (TaKaRa)分别对质粒pGEM-T-PnERFl和pCAMBIA2300S进行双酶切(100 yL体系)，反应体系和操作过程为:取20 μL pGEM-T-PnERFl或pCAMBIA2300S质粒，依次加入 10 yL 10ΧΜ buffer、5 yL Xba 1、5 yLSmal、60 yL ddH20,混匀后短时离心，置于37 °C过夜反应。将所有酶切产物点于琼脂糖凝胶中进行电泳，然后对PnERFl片段和pCAMBIA2300S大片段分别进行胶回收，整个过程使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)。取1 yL回收产物通过琼脂糖凝胶电泳检测回收片段的大小以及浓度，置于-20 °C保存备用。
[0019]利用T4 DNA Ligase (TaKaRa)，将回收的PnERFl DNA片段和pCAMBIA2300S载体片段连接起来，反应体系(20 yL)和操作过程为:取10 yL PnERFl DNA片段依次加入2 yLPCAMBIA2300S载体DNA、2 yL 10 XT4 DNA Ligase Buffer、1 yL T4 DNA Ligase、5 yLddH20，混匀后短时离心，置于16 °C水浴过夜反应。接着采用热激转化法将连接产物转入大肠杆菌Transl-Tl中，用含有50 mg/L卡那霉素(kanamycin，Km)的固体培养基筛选阳性克隆。挑选单菌落摇菌，以菌液为模板用扩增PnERFl的特异性引物进行PCR，挑选出PnERFl与PCAMBIA2300S成功连接的克隆，所检测的菌株若为阳性，加入20%甘油混匀后置于-80 °C保存备用。
[0020]用试剂盒提取并纯化上述大肠杆菌中的pCAMBIA2300S-PnERFl质粒。制备农杆菌EHA105菌株的感受态细胞并分装于1.5 mL离心管中，每管150 yL，液氮速冻后置于-80 °C保存备用。采用液氮冻融法将上述构建的植物表达载体pCAMBIA2300S-PnERFl转入所制备的农杆菌EHA105感受态细胞中。操作步骤为:取3 yg pCAMBIA2300S-PnERFl质粒加入含有150 yL感受态细胞的离心管中，轻轻混匀后冰浴30 min，接着转入液氮中速冻5 min，然后迅速置于37 °C水浴5 min，之后立即冰浴2 min，加入600 yL LB液体培养基，28 °C振荡培养4 h。将活化后的农杆菌涂于含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28 °C静置培养。挑选单菌落摇菌，用扩增PnERFl的特异引物进行PCR，检测pCAMBIA2300S-PnERFl是否转入农杆菌中。对于阳性克隆，加入甘油后置于-80 °C保存备用。
[0021]实施例3:农杆菌介导的三七遗传转化从-80 °C冰箱中取出保存的含有pCAMBIA2300S-PnERFl质粒的农杆菌EHA105菌种，接种于5 mL含有50 mg/L Km和25 mg/L利福平的LB液体培养基中，28 °C培养至浑浊。吸取1mL浑浊的菌液至含有50 mg/L Km的LB固体培养基上，28 °C培养48 h。将LB固体培养基上的农杆菌刮下适量接种于MGL液体培养基中，附加40 mg/L的乙酰丁香酮，28 °C振荡培养至OD6〇Q为0.6时停止摇菌，所得菌液用于侵染。
[〇〇22]将生长状态较好的三七愈伤组织接种到MS预培养基(含35 mg/L乙酰丁香酮)上进行预培养3天。预培养完成后，将愈伤组织完全浸泡于上述农杆菌菌液中进行振荡培养。浸染完毕，除去菌液，用无菌的滤纸吸取愈伤组织表面的菌液，再将愈伤组织接种到MS共培养基(含35 mg/L乙酰丁香酮)上进行共培养3天。共培养完成后，用无菌水对愈伤组织进行洗涤，再转接于含400 mg/L头孢霉素的MS培养基上进行除菌培养，于25 °C暗培养15天，防止农杆菌过度生长。最后将愈伤组织转接到筛选培养基中，每45天继代一次。经过5次筛选，最终分离出具有Km抗性的增值速度快的纯的细胞系，用于后续检测。
[〇〇23]实施例4: PnERF 1基因超表达对三七皂苷合成途径关键酶基因FPS、HMGR和SE表达量的影响选取25天左右、生长状态良好的三七转基因细胞系和野生型细胞系，分别提取RNA，然后按照GoTaq? 2-Step RT-qPCR System试剂盒说明书合成cDNA，反应体系和操作过程为:在离心管中加入4 yg 总RNA和 1 yL 01igo(dT)i5,用Nuclease-free Water补齐至 10 yL，将反应体系放于70 °C变性5 min，然后置于冰上5 min。随后将离心管在