一种聚乙二醇修饰trail重组蛋白的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方 法。
【背景技术】
[0002] 近年来，由于生物制药技术的发展使得蛋白质或多肽类药物大量生产成为可能， 但是多肽药物存在着体内循环的半衰期短、易在胃肠道内被蛋白水解酶破坏、水溶性差、抗 原性较强引起过敏、以及易于引起中和抗体的产生等缺点，限制着它的应用。因此，现有技 术中针对具有医疗作用的蛋白质或多肽进行PEG定点修饰来使其走向药物应用的技术被广 泛研究。蛋白质或多肽的聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG)修饰即PEG化 (PEGylation)，是将活化的PEG通过化学方法以共价键偶联到蛋白质或多肽分子上。自1977 年Davis首次采用PEG修饰牛血清白蛋白以来，PEG修饰技术迅速发展，并广泛应用于多种蛋 白质和多肽的化学修饰，PEG修饰技术也从理论走向实际的药物应用。
[0003] PEG修饰能赋予蛋白质和多肽类多种优良性能，具体表现为循环半衰期延长、免疫 原性降低或消失、毒副作用减少以及物理、化学和生物稳定性增强等，在很大程度上扩宽了 蛋白质和多肽的的应用范围。其机理可能为:蛋白质PEG修饰后，相对分子质量(Mr)增大，当 修饰后的蛋白质的Mr达到或超出肾小球滤过阈值时，蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以 逃避肾小球的滤过作用；由于PEG的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋 白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，因而可以在血液循环中停留更长的时间;PEG 在溶液中呈无规则卷曲，作为一种屏障，能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使得蛋白质不能 与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白 质的免疫原性;PEG与蛋白质偶联后能将其优良的理化性质赋予蛋白质，如能改善蛋白质的 生物分布和溶解性能。
[0004] 肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL) 也称为凋亡素-2 配体 (Apo_2L) ，是新近发现的肿瘤坏死因子 (TNF)基因超家族成员，属于II型跨膜蛋白（transmembrane protein)。TRAIL是一个由281 个氨基酸构成的II型跨膜蛋白，其中从第114个精氨（arginine)到第281个甘氨酸 (glysine)的序列为诱导癌细胞凋亡的主要功能区域。它能通过与死亡受体结合选择性诱 导多种肿瘤细胞与转化细胞发生凋亡，而对正常组织和细胞几乎没有不良反应。这一特性 使得TRAIL在肿瘤的靶向治疗中具有良好的应用前景，被认为是一种非常具有发展潜力的 抗肿瘤因子，近年已成为国内外研究的热点。但单体结构的TRAIL不能诱导细胞凋亡，只有 三聚体结构的TRAIL才能与死亡受体(DR4，DR5)相结合发挥细胞凋亡的作用。但是在自然情 况下TRAIL很难形成三聚体结构，把TRAIL应用到临床上仍有许多问题亟待解决。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是为解决利用聚乙二醇修饰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 的难题，提供一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，利用PET表达载体对人类TRAIL 基因（114-281序列）进行基因克隆制作出具有N-末端组氨酸标签(Histidine tag)和异亮 氨酸拉链基序（Leucine zipper)的TRAIL重组基因（PET23dw-His-ILZ-hTRAIL( 114-281)， 简称HZ-TRAIL)。利用PEGylation技术将TRAIL重组基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生产三 聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发明利用聚乙二醇修饰的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导 配体对抗肿瘤和抗类风湿关节炎具有高药效的优点。
[0006 ]为了达到上述技术效果，本发明技术方案包括：
[0007] -种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相 关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：
[0008] 步骤一 :HZ-TRAIL的制备:利用PET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列 进行基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因 PET23dw-His-ILZ-h TRAIL114-281 的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL;
[0009] 步骤二:HZ-TRAIL的提取和纯化:将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中， 并在含有lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷的LB培养液中进行扩繁处理，然后将HZ-TRAIL在大 肠杆菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后，取20ml上清液缓慢 注入到镍氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用 镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20°C， 备用；
[0010] 步骤三:PEG-HZ-TRAIL的制备:取重量份数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入 到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入聚乙二醇修饰剂和还原剂，在低温4 °C状态下进行N端氨基修饰，使PEG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为8-12小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物；
[0011]步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化:将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤 层析法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。
[0012] 所述步骤二中的扩繁处理条件为在25~30°C，扩繁6~9个小时。
[0013] 所述步骤二中的离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4°C，离心处理 20min〇
[0014]所述步骤三中的还原剂为NaCNBH3,所述加入还原剂的重量份数为0.13份。
[0015]优选地，所述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为2~10份。更优选地，所 述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为7.5份。优选地，所述步骤三中的反应时间为 8h〇
[0016] 所述的三聚体TRAIL重组蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示。一种经三聚体 TRAIL重组蛋白，适用于在大肠杆菌、酵母和哺乳动物细胞中表达。
[0017] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可诱导癌细胞或炎性淋巴细胞凋亡。
[0018] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于抗肿瘤药物中。
[0019] 所述的PEG-HZ-TRAIL蛋白可应用于类风湿性关节炎药物中。
[0020] 本发明的有益效果包括：
[0021 ] 1、本发明一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，利用PFG技术将HZ-TRAIL 改良成新的PEG-HZ-TRAIL，从而延长了HZ-TRAIL的半衰期、通过延缓蛋白的排泄，提高其抗 酶解的能力，增加其溶解性与稳定性，以及降低其免疫原性，显著延长了HZ-TRAIL的体内生 物活性。另外，通过进一步研究证明了 PEG-HZ-TRAIL在抗肿瘤和抗类风湿关节炎的药效。 [0022] 2、PEG-HZ_TRAIL可以诱导多种癌细胞的凋亡，而对正常组织和细胞无任何副作 用。
[0023] 3、PEG-HZ-TRAIL在RA发病过程中通过诱导炎性淋巴细胞的凋亡，降低炎症反应， 对关节起保护作用。
【附图说明】
[0024]图1所示为本发明一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白PEG-HZ-TRAIL制备模式图。 [0025]图2所示为本发明一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白HZ-TRAIL的制备模式图。
[0026] 图3A所示为在一般生理环境条件下HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化 图；
[0027] 图3B所示为在血浆溶液中HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL溶解度随时间变化图。
[0028] 图4所示为本发明实施例5 HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的药代动力学比较分析图。 [0029]图5所示为本发明实施例6 PEG-HZ-TRAIL对大肠癌细胞(HCT116)杀伤能力测定 图。
[0030]图6所示为本发明实施例6 PEG-HZ-TRAIL对结肠癌细胞(HCT116)的凋亡能力测定 图。
[0031 ]图7A所示为本发明实施例6 HZ-TRAIL和PEG-HZ-TRAIL的抗移植瘤效能比较分析 图；
[0032]图7