大豆花特异启动子GmAP1.4及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体地，涉及一种大豆花特异启动子 GmAP1.4及其应用。
【背景技术】
[0002] 启动子是基因中重要的顺式作用元件，一般位于转录起始位点上游几十个碱基 处。
[0003] 启动子根据转录模式不同可分为三种：组成型启动子、组织或器官特异性启动子 和诱导型启动子。组织或器官特异性启动子的活性是受特定的组织细胞结构和化学、物理 信号诱导调节的，即这类启动子的表达具有特定的时空性。在这类启动子的驱动下，基因的 表达往往只限于某些特定的器官或组织部位或特定的发育时期。组织或器官特异性启动子 不仅能使目的基因的表达产物在一定器官或组织部位积累，提高区域表达量，同时也可以 避免目标基因在其他组织器官中表达造成的不利影响。
[0004] 到目前为止，已有大量的组织或器官特异性启动子被分离出来，其中包括花特异 启动子和种子特异启动子。如花粉发育有关的组织特异性启动子如TA29、Lat52、0sg6B、 Zml3、Sl等已有详细研究报道;UBC6启动子(1&?8，1994)主要在花中表达汀8?1是水稻中绒 毡层特异启动子（马沁沁，2005);DefH9是子房特异启动子(Rotino，1997);PtNIPl是柏树胚 胎发育特异性启动子(Vincent，2002)。这些启动子都能特异启动目标基因的表达，改变特 异组织器官的发育。但大豆中花特异表达的启动子鲜有报道。
[0005] 成花过程是植物从营养生长向生殖生长的关键转折期，包括开花诱导、花的发端 和花器官发育三个阶段，受众多基因调控。调控植物成花过程的基因可分为:花序分生组织 特征基因、花分生组织特征基因、花器官形态特征基因等。API (APETALA1)基因属于植物花 分生组织特征基因和花器官形态特征基因，在控制植物花分生组织特性与花器官的形成过 程中起着重要的作用。
[0006] 因此有必要研究和获得调控大豆花API的启动子序列，从而为深入研究植物成花 过程、花的发端和花器发育提供有效手段和途径。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的在于获得调控大豆花API基因的启动子序列，从而为在各种作物、林 木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特异表达目标基因提供有效途径。
[0008] 为达到以上目的，本发明提供了一种大豆花特异启动子GmAPl .4,其具有：
[0009] a)SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；或
[0010] b)SEQ ID No. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得 的具有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。
[0011]例如，在不改变启动子功能的情况下，进行以下取代方式中的至少一种所获得的 核苷酸序列：将第26位的C取代为T，将第213位的C取代为T，将第2375位的G取代为A，将第 2387位的T取代为C。
[0012]本发明还提供了从拟南芥基因组中克隆得到2500bp的GmAPl.4启动子序列所用的 特异性引物序列，其包括正向引物:5 ' -TATGCACTTTCTACTTCGGTTTGGC-3 ' ；和反向引物:5 ' -GATGACAAGTGGTTTTGGTTTCTGG-3'。
[0013]本发明还提供了含有启动子GmAPl.4的载体以及含有所述载体的宿主细胞。
[0014] 本发明还提供了含有启动子GmAPl .4的转化植物细胞。
[0015] 本发明还提供了启动子GmAPl.4在调控下游基因表达中的应用，优选下游基因为 GUS基因。
[0016] 本发明还提供了启动子GmAPl.4在植物花发育调节中的应用。
[0017]在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，只要适合启动子GmAPl. 4的表达即 可，例如可以为市售的载体及质粒。
[0018] 本发明首次分离了大豆花特异启动子GmAPl. 4，利用启动子GmAPl.4过表达拟南芥 GUS基因，结果表明启动子GmAPl.4可明显促进植物花器官和胚胎中GUS基因的表达量，因 而，GmAPl. 4启动子在植物花器官具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植 物的花中特异表达目标基因。
【附图说明】
[0019]图1为质粒BDV1的结构示意图；
[0020]图2为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(雌蕊）中的表达结果；
[0021 ]图3为拟南芥GmAPl. 4-GUS在花器官(雄蕊）中的表达结果；
[0022] 图4为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(花瓣)中的表达结果；
[0023] 图5为拟南芥GmAPl.4-GUS在花器官(花萼）中的表达结果；；
[0024]图6为拟南芥GmAPl .4-GUS在花中的表达结果；
[0025]图7为拟南芥GmAPl .4-GUS在花序中的表达结果；
[0026] 图8为拟南芥GmAPl .4-GUS的PCR检测结果。
【具体实施方式】
[0027]下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0028] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029] 实施例1
[0030] 本实施例用于说明大豆GmAPl .4启动子的克隆
[0031] 利用正向引物5 ' -TATGCACTTTCTACTTCGGTTTGGC-3 ' 和反向引物5 ' -GATGACAAGTGGTTTTGGTTTCTGG-3'从大豆基因组中PCR扩增并测序获得长度为2500bp的 GmAPl.4启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0032] 上述PCR扩增体系为：（20μ1体系）
[0033]
[0034] PCR 程序：
[0035]
[0036] 实施例2
[0037] 本实施例用于说明大豆GmAPl .4启动子调控下游基因⑶S的表达情况。
[0038] 将GmAPl.4启动子克隆至入门载体并与⑶S基因融合，然后将获得的融合基因构建 至表达载体BDV1。
[0039] 过程如下:PCR克隆得到GmAP1.4启动子后，通过Solution I连接至带有GUS基因的 入门载体，并与之融合。采用GateWay重组克隆的方法（Invitrogen)，通过LR反应将启动子 及⑶S基因重组至目的载体BDV1上。BDV1的结构如图1所示、
[0040] 获得双元表达载体pGmAPl. 4: : GUS;将植物表达载体pGmAPl. 4: : GUS转化至大肠杆 菌DH5a中扩繁。大肠杆菌感受态细胞的转化，包括：（1)制备含氨苄青霉素的LB固体培养基； (2)取出贮存于-80°C的感受态细胞，冰浴中融化后，加入2μ1质粒轻轻混匀，冰浴中放置30 分钟；（3)42°C热激30秒，然后立即置于冰浴中3分钟；加入300μ1不含抗生素的LB液体培养 基，37°C摇床振荡培养1小时（160rpm);(4)取适量培养液均匀涂于选择性培养基上，37°C倒 置培养16小时，用灭菌牙签挑取5-10个(或更多)菌落，置于200μ1选择性液体LB培养基中摇 菌培养；（5)PCR检测筛选到的阳性克隆（图8)。通过农杆菌介导转化方法，将pGmAPl. 4: : GUS 转入拟南芥，获得转化pGmAPl. 4: :GUS的拟南芥2株;通过⑶S活性分析表明，GmAPl. 4启动子 在植物的雌蕊(图2)、雄蕊(图3)、花瓣(图4)、花萼（图5)、花(图6)及花序(图7)中特异表达， 可用于包括各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等在内的各种植物的花和胚胎中特异表达目 标基因。
[0041 ] 拟南芥⑶S染色：
[0042] (1)将组织样品加入90%丙酮中，置于冰上20~30分钟；
[0043] (2)经丙酮处理后，用50mM磷酸缓冲液(pH7.2)、2mM K4Fe[CN]6及2mM K3Fe[CN]6溶 液润洗组织；
[0044] (3)将样品放在X -Glue染色液中（50mM磷酸缓冲液（pH7.2)，lmM X-gluc，2mM K4Fe[CN]6,2mM K3Fe[CN]6)，抽气 10分钟，然后37°C染色过夜；
[0045] (4)第二天用70%乙醇脱色；
[0046] (5)在载玻片上加几滴HCG溶液，将脱色后的样品置于其中；
[0047] (6)压片，透明15分钟或者过夜透明（根据组织的发育时期而定）。
[0048] GUS染色液配方：
[0049] 20mM X-gluc(MW=521.8)
[0050] 用DMS0或N，N-二甲基甲酰胺溶解，100mg X-gluc需用9.58ml DMS0溶解，终浓度为 20mM〇
[0051 ] 50mM 磷酸缓冲液(ρΗ7·0)
[0052] Α液:NaH2P〇4 · 2Η2Ο 3.12g溶于无菌蒸馈水，定容至100ml;
[0053] B液:Na2HP〇4 · I2H2O 7.17g溶于无菌蒸馈水，定容至100ml;
[0054] 取39mlA液与61mlB液混合。
[0055] 染色液配制：5mM铁氰化钾;5mM亚铁氰化钾；10mM EDTA; 50mM磷酸缓冲液；ImM X-gluc〇
[0056] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 大豆花特异启动子GmAPl. 4，其特征在于，其具有： a)SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列；或 b)SEQIDNo. 1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸所获得的具 有同等功能的由a)衍生的核苷酸序列。2. 根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述启动子是进行以下取代方式中的至 少一种所获得的核苷酸序列:将第26位的C取代为T，将第213位的C取代为T，将第2375位的G 取代为A，将第2387位的T取代为C。3. 含有权利要求1或2所述启动子的载体。4. 含有权利要求3所述载体的宿主细胞。5. 含有权利要求1或2所述启动子的转化植物细胞。6. 权利要求1或2所述的启动子在调控下游基因表达中的应用。7. 权利要求1或2所述的启动子在植物花发育调节中的应用。8. 权利要求1或2所述的启动子的特异性引物序列，其特征在于，包括： 正向引物：5 ' -TATGCACTTTCTACTTCGGTTTGGC-3 ' ； 反向引物：5'-GATGACAAGTGGTTTTGGTTTCTGG-3'。
【专利摘要】本发明提供了一种大豆花特异启动子GmAP1.4，其核苷酸序列如SEQ？ID？No.1所示。还提供了所述启动子在调控下游基因表达中的应用。利用启动子GmAP1.4过表达拟南芥GUS基因，结果表明启动子GmAP1.4可明显促进植物花器官中GUS基因的表达量，因而，GmAP1.4启动子在植物花器官中具有特异性，适合在各种作物、林木、蔬菜、花卉、牧草等植物的花中特异表达目标基因。
【IPC分类】C12N15/82, C12N15/11, A01H5/02, C12N15/113, C12N5/10
【公开号】CN105441450
【申请号】CN201510893807
【发明人】傅永福, 张晓玫, 陈福禄, 宋拉拉
【申请人】中国农业科学院作物科学研究所
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月7日