浆器充分乳化。b)免疫动物时，在小鼠尾 根部多点皮内注射0.1ml乳剂(含lOOmg CII和200mg结核分枝杆菌）。基础免疫后第21天以 同样方法重复，避开初次免疫部位，进行加强免疫。
[0105] ③药物处理:a)分为5个实验组，即野生型小鼠（对照组）10只，阳性对照组(PBS)IO 只，以及处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠（50yg/mouse，150yg/mouse，300yg/mouse)各10 只，总共50只。b)对于处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠，加强免疫后第21天开始每3天或 每1周处理1次（i.p，50yl)药物，直到实验结束(初次免疫后第51天)为止。如图8所示建立类 风湿关节炎动物模型和处理药物流程。
[0106] ④检测分析:通过观察关节和关节外病变及利用关节炎评分方法，比较分析各组 之间RA的各种指标包括关节炎临床指数(Clinical score)，发病率(Incidence)等。评分方 法:《0》无红肿；《1》关节红不肿；《2》关节轻度红肿；《3》关节中度红肿；《4》关节重度红肿伴 功能障碍。关节炎分数为每只小鼠所有病变关节分数的总和，最高分为16分。测定结果见图 9A PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠（CIA)治疗的浓度依赖性关节炎指标的变化图， 图9B PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎模式小鼠（CIA)治疗的浓度依赖性发病率变化图。由图 9结果可知，PEG-HZ-TRAIL对类风湿关节炎具有良好的治疗效果。CIA的临床指数也随药物 浓度的增加而逐渐减少。同样其CIA发病率随药物浓度的增加而逐渐降低。
[0107] (2)PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对炎症反应的调控作用
[0108] 实验方法：
[0109] ①采样:将上述药物处理③野生型小鼠（对照组）、阳性对照组(PBS)、以及处理不 同浓度PEG-HZ-TRAIL的小鼠（初次免疫后第51天），利用乙醚麻醉脱颈处死小鼠并采样，包 括肘关节、膝关节，外周血清，以及组织脏器等。关节除去病变关节的皮毛和多余的皮下组 织、保留跖趾关节，并用4%多聚甲醛固定，10%EDTA脱钙，常规脱水，石蜡包埋，切片。
[0110]②检测分析:a)利用组织病理学方法(H/E staining)比较分析各组之间肘关节和 膝关
[0111] 节的炎症程度(滑膜细胞与炎性淋巴细胞浸润）。13)利用EILSA方法和免疫染色方 法比较分析各组之间外周血请以及关节腔中的炎性介子(TNF-α，IL- 1β，IL-2，IFN- γ )的水 平。
[0112] 测定结果见图10对类风湿关节炎小鼠模型(CIA)处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL后关 节组织病理学变化图，由图10结果可知，PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发病过程中对炎症 具有良好的抑制效果，炎性淋巴细胞和滑膜细胞的浸润程度随药物浓度的增加而逐渐降 低。
[0113] 图11对类风湿关节炎小鼠模型（CIA)处理不同浓度PEG-HZ-TRAIL后，血清中促炎 介质水平的变化图。图11A、图11B、图11C和图11D所示可知PEG-HZ-TRAIL在类风湿关节炎发 病过程中对炎症具有良好的抑制效果，血清中促炎介质（TNF-a，IL-Ιβ，IFN- γ，IL-2)的水 平随药物浓度的增加而逐渐降低。
[0114] 由上述内容可知，本发明提供的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，利 用
[0115] PET表达载体对人类TRAIL基因（114-281序列）进行基因克隆制作出具有N-末端组 氨酸标签(Histidine tag)和异亮氨酸拉链基序（Leucine zipper)的TRAIL重组基因 (PET23dw-His-ILZ-hTRAIL( 114-281 )，简称 HZ-TRAIL)。利用PEGylation 技术将 TRAIL 重组 基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL，生产三聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发明的利用聚乙 二醇修饰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对抗肿瘤和抗类风湿关节炎具有高药效的优点。
[0116] 上述详细说明是针对发明的可行实施例的具体说明，该实施例并非用以限制本发 明的专利范围，凡未脱离本发明的等效实施或变更，均应当包含于本发明的专利范围内。
[0117] 另外，本领域技术人员还可在本发明权利要求公开的范围和精神内做其它形式和 细节上的各种修改、添加和替换。当然，这些依据本发明精神所做的各种修改、添加和替换 等变化，都应包含在本发明所要求保护的范围之内。
[0118]
【主权项】
1. 一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述诱导配体为肿瘤坏 死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤： 步骤一:HZ-TRAIL的制备:利用PET表达载体对人类TRAIL蛋白中114-281基因序列进行 基因克隆，制备出具有N-末端组氨酸标签和异亮氨酸拉链基序重组基因PET23dw-His-ILZ-hTRAIL114-281的TRAIL重组蛋白，简称HZ-TRAIL; 步骤二:HZ-TRAIL的提取和纯化:将步骤一制备出的HZ-TRAIL转化到大肠杆菌中，并在 含有lmmol/L异丙基硫代半乳糖苷的LB培养液中进行扩繁处理，然后将HZ-TRAIL在大肠杆 菌中重组表达，大肠杆菌细胞通过声波降解法裂解，并离心处理后，取20ml上清液缓慢注入 到镍-氮三乙酸螯合琼脂糖柱中，使HZ-TRAIL中的组氨酸和金属镍离子充分吸附，利用镍-亲和色谱法进行逐步洗脱提取HZ-TRAIL，再经凝胶过滤层析法进行纯化，保存在-20°C，备 用； 步骤三:PEG-HZ-TRAIL的制备:取重量份数为1份的步骤二制备出的HZ-TRAIL加入到pH为5.0重量份数为0.15份的醋酸盐缓冲液中，加入聚乙二醇修饰剂和还原剂，在低温4°C状 态下进行N端氨基修饰，使TOG以共价键偶联到HZ-TRAIL蛋白的N端氨基上，即为PEG-HZ-TRAIL蛋白，反应时间为8-12小时，得到生成PEG-HZ-TRAIL蛋白的反应混合物； 步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化:将所述步骤三制备出的反应混合物利用凝胶过滤层析 法进行分离纯化，然后通过超滤法浓缩，最终得到PEG-HZ-TRAIL。2. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤二中的扩繁处理条件为在25~30°C，扩繁6~9个小时。3. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤二中的离心处理条件为调节转速为12000rpm，温度为4°C，离心处理20min。4.根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤三中的还原剂为NaCNBH3，所述加入还原剂的重量份数为0.13份。5. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为2~10份。6. 根据权利要求5所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤三中加入聚乙二醇修饰剂的重量份数为7.5份。7. 根据权利要求1所述的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，其特征在于， 所述步骤三反应时间为8h。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，所述诱导配体为肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体TRAIL，所述制备方法为化学修饰方法，包括以下步骤：步骤一：HZ-TRAIL的制备；步骤二：HZ-TRAIL的提取和纯化；步骤三：PEG-HZ-TRAIL的制备；步骤四：PEG-HZ-TRAIL的纯化。本发明提供的一种聚乙二醇修饰TRAIL重组蛋白的制备方法，利用PEGylation技术将TRAIL重组基因改良成新的PEG-HZ-TRAIL重组蛋白的方法，使得制备出三聚体的高活性TRAIL蛋白质，并且本发明利用聚乙二醇修饰肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体对抗肿瘤和抗类风湿关节炎具有高药效的优点。
【IPC分类】C07K1/113, C07K1/16, C07K14/705, A61K47/48, C12N15/12, A61P35/00, C07K1/22, A61P29/00, A61P19/02, C12N15/70, A61K38/17
【公开号】CN105441453
【申请号】CN201510875293
【发明人】金成浩, 罗英花, 孙虎男, 韩英浩, 臧延青, 刘畅
【申请人】黑龙江八一农垦大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年12月3日