针对hpv18e7基因的小干扰rna及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及双链核糖核酸（dsRNA)，并涉及其通过RNA干扰（RNAi)作用来预防及 治疗人乳头瘤病毒18亚型（HPV18)感染所引起的相关疾病的用途，其中所述疾病例如宫颈 癌、外阴癌、食管癌、乳腺癌、肺癌等癌症，以及由HPV16所引起的癌前病变和生殖器疣等疾 病。
【背景技术】
[0002] 1998年，Andrew Z. Fire和Craig C. Mello共同发现了体内RNA干扰的作用机制， 并于2006年共同获得了诺贝尔生理医学奖。从而为抵抗病毒、癌症等严重疾病的新一代药 物（RNA干扰类药物）的研发开启了一扇大门。此RNA干扰类药物具有作用方式新颖、作用 机制明确、靶向性强和副作用小等优点。
[0003] 人类乳突病毒（Human Papillomavirus,简称HPV)，属于乳多空病毒科乳头瘤病毒 属，是一种小型无包膜的病毒颗粒，呈球形，二十面体对称，直径约45-55nm，病毒的核心为 双链DNA ;病毒衣壳由两种结构蛋白构成的72个壳微粒组成。病毒DNA包含约8000碱基 对，其中包括8个早期开放读码框架（E1-E8)、2个晚期读码框架（L1和L2)和1个非编码 长控区（LCR)。在早期开放读码框架中，E6和E7基因对细胞生长刺激最为重要，单独E7编 码的E7蛋白就可以引起宫颈上皮细胞永生化。而晚期读码框L1和L2基因分别编码HPV 的主要和次要衣壳蛋白，组装成HPV的衣壳。
[0004] HPV是世界上最流行的性传染疾病源之一，同时也是一类重要的人类肿瘤病毒。目 前已经鉴定超过100种HPV病毒的亚型。HPV各型之间有共同抗原，存在于L1蛋白保守区 域，这些抗原具有属特异。依其感染的上皮所在部位：分为皮肤上皮型HPV和粘膜上皮型 HPV。
[0005] 最早确定以及最重要的HPV相关肿瘤是宫颈癌，其发病率仅次于乳腺癌，是严重 威胁女性健康的杀手。据统计每年世界范围内约有490, 000例左右的新发病例，其中约 130, 000发生在中国，每年约有270, 000人死于该疾病，约50, 000是中国人。随后，更发现 外阴癌、食管癌、乳腺癌甚至肺癌等恶性肿瘤的发生、发展都与HPV感染相关。迄今发现的 100多种HPV亚型中，高致癌的HPV亚型（即高危型HPV)有10多种，包括HPV16、18、31、52、 58等。目前认为，HPV感染对宫颈癌的发生是必要但非充分的。据研究显示，99.7%宫颈癌 患者存在HPV感染。
[0006] 已感染HPV的女性初期症状不明显。通过基于对异常宫颈细胞组织学评估的Pap 测试以及基于核酸的PCR及杂交技术可以确定HPV的存在并确定HPV亚型。异常宫颈细胞 分级为低度鳞状上皮内病变（LSIL)和高度鳞状上皮内病变（HSIL)。其中LSIL包括宫颈上 皮内瘤变一级（CINI)的细胞；HSIL包括宫颈上皮内瘤变二级（CINII)和三级（CINIII)的 细胞。
[0007] 目前用于治疗HPV感染的药物及疗法主要有：1、鬼臼树脂（podophyllin) ;2、 鬼白毒素口〇(1〇口11711〇1：(?;[11(口0(10111(?);3、三氯乙酸（1^)/二氯乙酸（1^六） ；4、冷冻 疗法；5、手术切除；6、干扰素（IFN) ;7、咪喹莫特 hniquimod[l-(2-methylpropyl)-lH-imidazo(4,5-quinolin-4-amine)] ;8、5-氟尿啼陡/肾上腺素；9、无环核苷酸类似物 Cidofovir (HPMPC ： [5]-1-[3-hydroxy-2-phosphonylmethoxy-propyl]-cytosine)等等。 然而，临床上应用的这些抗病毒以及其它抗肿瘤类药物的不但特异性不强，而且副作用大。 目前世界上没有一种特异、高效的抑制HPV的药物来降低甚至抑制其相关癌症的发生和发 展。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种针对HPV18E7基因的小干扰RNA。
[0009] 本发明的第二个目的是提供包括针对HPV18E7基因的小干扰RNA的组合物。
[0010] 本发明的第三个目的是提供针对HPV18E7基因的小干扰RNA的用途。
[0011] 本发明的技术方案概述如下：
[0012] 针对HPV18E7基因的小干扰RNA，该小干扰RNA分子的靶序列分离自HPV18E7基 因，其中所述靶序列为SEQ ID N0:8所示的序列。
[0013] 所述小干扰RNA指导细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7 基因表达的抑制，该小干扰RNA分子包含与SEQ ID N0:8所示的序列互补的序列，正义链为 SEQ ID N0:25所示的序列，反义链为SEQ ID N0:26所示的序列。
[0014] 所述小干扰RNA中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，其中所述化学修饰为如 下修饰中的至少一种：
[0015] (1)连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
[0016] ⑵核糖的2' -OH的修饰；
[0017] (3)碱基的修饰。
[0018] -种包含上述针对HPV18E7基因的小干扰RNA和药学上可接受的载体组成的组合 物。
[0019] 所述药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。
[0020] 针对HPV18E7基因的小干扰RNA在制备抗癌药物中的应用。
[0021] 为解决上述问题，本发明提供了通过小干扰核酸分子抑制引起细胞良性和恶性增 生的HPV18E7基因表达，来预防和治疗HPV18感染相关疾病的解决方案。
[0022] 在本发明的第一方面，提供了小干扰核酸分子在制备用于抑制HPV18E7基因在细 胞中表达的制剂中的应用，所述小干扰核酸分子指导所述细胞中存在的HPV18E7mRNA序列 的剪切，从而实现所述的抑制。在本发明中，所述小干扰核酸分子包含正义核酸片段和反义 核酸片段，所述正义核酸片段和所述反义核酸片段含有互补区域，互补区域能形成双链核 酸结构，该双链核酸能够抑制HPV18E7基因在细胞中的表达。小干扰核酸的正义核酸片段 和反义核酸片段可以存在于两条不同的核酸链上，也可以存在于同一条核酸链上。当正义 核酸片段和反义核酸片段分别位于两条链上时，小干扰核酸的至少一条链具有长度为〇至 6个核苷酸的3'突出端，优选情况下两条链都具有长度为2-3个核苷酸的3'突出端。当正 义核酸片段和反义核酸片段存在于同一条核酸链上时，优选情况下该小干扰核酸为发夹型 单链核酸分子，其中正义核酸片段和反义核酸片段的互补区域形成双链核酸结构。上述小 干扰核酸分子中，正义核酸片段和反义核酸片段的长度为19至29个核苷酸，可以为19、20、 21、23、25、27和29个，优选为19、21、25、27个核苷酸。上述小干扰核酸分子可以被直接导 入所述细胞中，也可以是将编码该小干扰核酸分子的核苷酸序列导入所述细胞后在细胞内 产生；所述细胞优选为哺乳动物细胞，更优选为人类细胞。上述细胞可以是离体的，如细胞 系，也可以存在于哺乳动物体中，如人体中。该人体是患有HPV感染症状的患者，并且所述 小干扰核酸分子被施用足够的量以实现对所述症状的治疗，所述HPV感染症状为子宫颈癌 或者尖锐湿抚。
[0023] 本发明第二方面提供了一种分离的HPV18E7基因小分子干扰核酸靶序列，其中所 述靶序列为HPV18E7的mRNA(cDNA)上任意连续19-30个核苷酸序列，优选的，所述靶序列 为表1中SEQ ID NO :1_10中任意一条序列。
[0024] 在本发明的第三方面，提供了一种小干扰核酸分子，其指导细胞中存在的 HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7表达的抑制，优选情况下该小干扰核酸分子 包含与表1中SEQ ID NO :1-10中任意一条序列互补的序列。上述小干扰核酸分子中所有 的核苷酸都可以为天然的未经化学修饰的核苷酸，也可以至少有一个核苷酸是化学修饰的 核苷酸，化学修饰方式选自如下修饰中的至少一种：
[0025] (1)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
[0026] (2)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的核糖的2' -OH的修饰；
[0027] (3)对所述小干扰核酸分子的核苷酸序列中的碱基的修饰。
[0028] 本发明所述的小干扰核酸与表达HPV18E7mRNA的细胞接触后可有效降低 HPV18E7mRNA的表达量
[0029] 本发明最后还提供了一种包含上述任一项所述的小干扰核酸分子和药