学上可接 受的载体的组合物，优选情况下，药学上可接受的载体为脂质体或高分子聚合物。
[0030] 本发明的有益效果
[0031] 本发明提供的针对HPV18E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制 HPV18E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV18E7基因表达的药 物。
【具体实施方式】
[0032] 本发明通过RNA干扰方式沉默能够引起细胞良性和恶性增生的HPV18E7基因表 达，来预防和治疗HPV18感染相关疾病这一问题。本发明中HPV18E7基因有时也称为HPV 靶基因。
[0033] 本发明提供的小干扰核酸分子包括具有长度低于30个核苷酸并且基本互补于至 少部分HPV靶mRNA转录物的区域的核酸片段（反义片段）。这些小干扰核酸分子的使用可 以通过被称为RNA干扰（RNAi)的过程导致HPV靶基因 mRNA被剪切。本发明提供的小干扰 核酸分子可以天然的未经修饰的核酸分子，也可以对其中至少一个核苷酸进行化学修饰。 根据本发明，所述化学修饰为如下修饰中的至少一种：
[0034] (1)对所述siRNA的核苷酸序列中连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰；
[0035] (2)对所述siRNA的核苷酸序列中核糖的2' -OH的修饰；
[0036] (3)对所述siRNA的核苷酸序列中碱基的修饰。
[0037] 所述化学修饰为本领域技术人员所公知，所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯 键中的氧进行修饰，包括硫代磷酸修饰，如式1所示；和硼烷化磷酸盐修饰，如式2所示。两 种修饰都能稳定siRNA结构，保持碱基配对的高特异性和高亲和力。
[0038]
[0039] 所述核糖修饰是指对核苷酸戊糖中2' -OH的修饰，即，在核糖的羟基位置引入某 些取代基，例如，2' -氟代修饰，如式3所示；2' -氧甲基修饰，如式4所示；2' -氧亚乙基 甲氧基修饰，如式5所示；2, 4'-二硝基苯酚修饰，如式6所示；锁核酸（LNA)，如式7所示； 2' -氨基修饰，如式8所示；2' -脱氧修饰，如式9所示。
[0040]
[0041]
[0042] 所述碱基修饰是指对核苷酸的碱基进行修饰，例如，5 ^ -溴尿嘧啶修饰，如式10 所示；5'-碘尿嘧啶修饰，如式11所示；N-甲基脲嘧啶修饰，如式12所示；2, 6 -二氨基 嘌呤修饰，如式13所示。
[0043]
[0044]
[0045] 这竺修r巾口」以増刀口尸λ还小十杌後酸分于的王物口」利用饪，捉咼与早⑴予夕ij的亲和 性，增强在细胞内抵抗核酸酶水解的能力。
[0046] 此外，为了促进小干扰核酸分子进入细胞，可以在以上修饰的基础上，在小干扰核 酸分子的正义链的末端引入胆固醇等亲脂性的基团以利于通过由脂质双分子层构成的细 胞膜与细胞内的mRNA发生作用。
[0047] 通过基于细胞及动物水平的测试，发明人证实这些小干扰核酸分子可以有效地介 导RNAi，导致HPV18E7基因表达的显著抑制，并抑制植入瘤体的生长。因此，包含本发明的 小干扰核酸分子可以通过靶向HPV靶基因来治疗由HPV感染介导的病理过程。
[0048] 本发明提供的小干扰核酸分子的制备方法包括序列设计和序列合成。
[0049] 所述小干扰核酸分子序列的合成可以采用化学合成的方法，或者委托专门从事核 酸合成的生物技术公司合成，如委托上海艾博思生物科技有限公司进行合成。
[0050] -般来说，所述化学合成的方法包括以下四个过程：（1)寡聚核糖核苷酸的合成； (2)脱保护；（3)纯化分离；(4)脱盐。
[0051] 例如，具有HPV18E7si01所示核苷酸序列的siRNA化学合成的具体步骤如下：
[0052] (1)寡聚核糖核苷酸的合成
[0053] 在自动 DNA/RNA 合成仪（例如，Applied Biosystems EXPEDITE8909)上设定 合成1毫摩尔的RNA，同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟，起始物为固相连接的 5'-0_对二甲氧基-胸苷支持物，第一个循环在固相支持物上连接一个碱基，然后在第η次 (19 > η > 2)循环中，在第η-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基，重复此循环直至完成 全部核酸序列的合成。
[0054] (2)脱保护
[0055] 将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中，并在此试管中加入1毫升的乙醇/ 乙胺（体积比为1 :3)，然后密封，置于55-70°C温箱中，孵育2-30小时，取出连接有siRNA 的固相支持物并用双蒸水淋洗2次（每次1毫升），收集洗脱液，并在室温下干燥30分钟。 然后，加入1毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液（1M)，室温放置4-12小时，再加入2毫升乙 醇，收集沉淀即得到siRNA的粗产物。
[0056] (3)纯化分离
[0057] 将得到的siRNA的粗产物溶解于2毫升浓度为1摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中， 然后通过C18高压液相色谱进行分离，得到纯化的siRNA产物。
[0058] (4)脱盐
[0059] 用浓度为75重量％的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次（每次2毫升）， 以除去盐份，并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升 的缓冲液中（10mM Tris，pH= 7.5-8.0,50mM NaCl)，将此溶液加热至95°C，然后缓缓将此 溶液冷却至室温，并维持室温16-22小时，得到含有siRNA的溶液。
[0060] 本研究发现，将上述SiRNA转染细胞后，能够有效抑制细胞及动物异体移植瘤内 HPV16E6RNA和蛋白的表达。
[0061] 下面结合具体实施例及附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常 按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册（NewYork:ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0062] 实施例1 :设计HPV18E7小干扰核酸序列
[0063] HPV18E7mRNA序列从美国国立卫生院建设的生物医学网站NCBI数据库（http:// www. ncbi. nlm. nih. gov/)中得到，在siDESIGN Center和DSIR在线设计特异性针对该基 因的siRNA序列。通过在线软件定义的选取小干扰核酸分子序列的原则是：主要基于结合 有小干扰核酸分子序列和目标序列特征的线性模型。小干扰核酸分子5'末端的高稳定性 可能阻断小干扰核酸分子正义链装载入RNA诱导沉默复合体（RISC);小干扰核酸分子反义 链5'末端的低稳定性可能促进小干扰核酸分子反义链装载入RISC ;以及小干扰核酸分子 中间区域的低稳定性可以促进RISC-小干扰核酸分子复合体释放。
[0064] 根据上述小干扰核酸分子序列的设计原则，设计出包含正义链和反义链的dsRNA HPV18E7si01~HPV18E7silO的10个针对HPV18E7的小干扰核糖核酸序列（siRNA)(见下 表2)，所述小干扰核酸分子在正义链和反义链的3'端包含2个脱氧胸苷酸（T)。所述dsRNA 中，HPV18E7si01~HPV18E7silO全长为21bp的带有两个核苷酸3'突出末端的结构。正 义链中加粗表示的是经过2' -甲氧基修饰的核苷酸。
[0065] 表1. HPV18E7基因靶序列
[0066]
[0067] 表2HPV18E7小干扰核糖核酸序列
[0068]
[0069] 实施例2 :体外验证所述dsRNA序列抑制HPV18E7表达的效率
[0070] ( -）细胞培养
[0071] 人宫颈癌细胞系（HeLa，ATCC)应用含有1%的青霉素-链霉素（PS，Gibco)抗生 素合剂和10%小牛血清（FBS，Gibco)的MEM培养基（Gibco)，在37°C、5%二氧化碳和95% 空气湿度的细胞培养箱中培养。
[0072](二）细胞转染
[0073] (1)转染前一天，HeLa细胞在培养基中接种，至转染时细胞的汇合度为30~50%。
[0074] (2)制备转染样品：
[0075] 分别将1 μ 1浓度为20 μ Μ的siRNA (见表1)和0· 5 μ 1细胞转染试剂 Lipof ectamine?2000 (Invitrogen)稀释于 0· 05ml Opti-M