EM (Invitogen)，轻轻混匀，孵育 5分钟。轻轻混匀，孵育5分钟。
[0076] 以无意义对照s iRNA (其正义链包含：5-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ;反义链包 含：5-ACgUgACACgUUCggAgAA_3)和细胞转染试剂 Lipofectamine?2000(Invitrogen)进行 转染，作为正常对照组（NC组）。
[0077] 取稀释的siRNA组和NC组，轻轻混合，在室温下孵育20分钟，形成siRNA-Lipofe ctamine2000(Invitrogen)复合物和无意义 siRNA-Lipofectamine2000(Invitrogen)复合 物。孵育时间不超过30分钟，更长的孵育时间可能会降低活性。
[0078] 将siRNA-LipofectamineTM2000复合物加入到每一个包含细胞和培养基的孔中， 通过轻轻地前后摇动培养板混合，在37°C，C02培养箱孵育24小时。不需要去除复合物或 者改换培养基。然而，在转染后4~6小时改换培养基也不会损失转染的活性。
[0079] 表3给出了通过各种组织培养方式转染细胞时使用试剂的优选的量和体积。
[0080] 表3转染细胞时使用试剂的量和体积
[0081]
[0082] (三）总RNA提取、反转录和实时定量PCR检测基因表达
[0083] 转染过后24小时，收集细胞。培养的细胞用TAKARA公司的RNA抽提试剂（RNAiso Plus, TAKARA，Cat. No. 9108)来进行细胞RNA的抽提。吸出细胞培养液，用1 XPBS清洗一 次。每10cm2生长的培养细胞中加入l-2ml的RNAisoPlus，轻微晃动，确保使裂解液均匀分 布于细胞表面。将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无 明显沉淀。室温（15-30°C)静置5分钟，然后从核蛋白中分离RNA。向匀浆裂解液中加入 氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色。室温静置5 分钟，12, 000g4°C离心15分钟。从离心机中取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的 上清液（含RNA)、中间的白色蛋白层（大部分为DNA)及带有颜色的下层有机相。吸取上 清液转移至另一新的离心管中。向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀 后，室温下静置10分钟。12, 000g4°C离心10分钟。弃去上清，加入与RNAisoPlus等量的 75 %乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7, 500 Xg4°C离心5分钟后小心弃去上清，打开 离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的RNase-free水溶解沉淀。
[0084] 将 100ng 抽提的 RNA 用 TAKARA 公司的 PrimeScriptTM RT Master Mix(PerfectReal Time) (Cat. No. RR036A)反转录成 cDNA。将提取的 RNA 用 DEPC 水吹起 Inhibitor、Random6mers、01igo dT Primer、dNTP Mixture、反应 Buffer),放入 37°C水浴 15分钟，85°C水浴5秒，然后快速冰浴。
[0085] 以此cDNA为模板进行实时定量多聚酶链式反应（Real time PCR)来定量检测 HPV18E7mRNA的表达水平。首先采用SDS2. 1软件相对标准曲线法计算mRNA表达水平，从相 应的曲线中确定周期阈值（Ct)，周期阈值反映每个目标基因的相对表达水平。然后，通过细 胞内参照基因（甘油醛-3-磷酸脱氢酶，简写为GAPDH)对照划分目标量获得常态目标值， 从而确定mRNA的相对表达水平。
[0086] 实验中用到的引物序列：
[0087] HPV1SE7 上游引物：5-ATTCCGGTTGACCTTCTATG_3
[0088] HPV18E7 下游引物：5-TCGGGCTGGTAAATGTTGAT-3
[0089] GAPDH 上游引物：5-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3
[0090] GAPDH 下游引物：5-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3
[0091] 计算所siRNA抑制基因表达的效率可通过下述公式计算：
[0092]
[0093] 公式中"处理细胞"是指分别转染表1中siRNA的细胞，"对照细胞"是指转染无意 义对照siRNA的细胞，"相对表达值"是指细胞中HPVE7mRNA与GAPDHmRNA的比值。
[0094] 表4显示转染24小时后所述siRNA的抑制HPVE7mRNA表达的效率。
[0095] 表4siRNA对HPV18E7mRNA表达的抑制效率
[0096]
[0097] 实施例3 :体外验证所述dsRNA序列抑制人宫颈癌细胞系HeLa的增殖
[0098] (一）细胞培养
[0099] 同上
[0100](二）细胞转染
[0101] 同上
[0102] (三）四唑盐（MTT)测定细胞抑制率
[0103] 每孔加1/10培养基体积的MTT溶液（5mg/ml，即0. 5% MTT)，继续培养4小时。终 止培养，吸去孔内培养液，每孔加入150 μ 1 DMS0,置摇床上低速振荡10分钟，使结晶物充 分溶解。在酶联免疫检测仪0D570nm处测量各孔的吸光值。按下式计算细胞抑制率：细胞 抑制率=(1 一处理组吸光度值/对照组吸光度值）X 100%。实验结果如下表5显示，
[0104] 表5siRNA对宫颈癌细胞系（HeLa)生长抑制率
[0105]
[0106]
[0107] 实施例4 :小鼠体内实验验证注射所述siRNA序列能够抑制植入宫颈癌细胞的生 长
[0108] 将宫颈癌细胞（HeLa)注射到6周大BALB/c雌性裸鼠背部皮下荷瘤，每个小鼠注 射2xl0 6个细胞。荷瘤后第14天在瘤上用微针注射HPV18E7si08和无意义dsRNA，每隔三 天注射一次，每次注射5 μ 1 siRNA溶液（10 μ g/ μ 1)。荷瘤后第23天分析瘤体重量。实验 结果如下表6显示，HPV18E7si08dsRNA能抑制植入瘤体的生长。
[0109] 表6HPV18E7si08抑制植入瘤体的生长
[0110]
【主权项】
1. 针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征在于该小干扰RNA分子的靶序列分离自 HPV18E7基因，其中所述靶序列为SEQIDN0:8所示的序列。2. 根据权利要求1所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征是所述小干扰RNA 指导细胞中存在的HPV18E7mRNA序列的剪切，从而实现对HPV18E7基因表达的抑制，该小干 扰RNA分子包含与SEQIDNO: 8所示的序列互补的序列，正义链为SEQIDNO: 25所示的序 列，反义链为SEQIDNO:26所示的序列。3. 根据权利要求2所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA，其特征是所述小干扰RNA 中至少一个核苷酸为化学修饰的核苷酸，其中所述化学修饰为如下修饰中的至少一种： (1) 连接核苷酸的磷酸二酯键的修饰； (2) 核糖的2' -0H的修饰； (3) 碱基的修饰。4. 一种包含权利要求2或3所述的针对HPV18E7基因的小干扰RNA和药学上可接受的 载体组成的组合物。5. 根据权利要求4所述的组合物，其特征在于所述药学上可接受的载体为脂质体或高 分子聚合物。6. 权利要求1-3之一的针对HPV18E7基因的小干扰RNA在制备抗癌药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了针对HPV18E7基因的小干扰RNA及其应用，针对HPV18E7基因的小干扰RNA，该小干扰RNA分子的靶序列分离自HPV18E7基因，其中所述靶序列为SEQ？ID？NO:8所示的序列。本发明提供的针对HPV18E7基因表达的小干扰核酸分子，能够高效、特异地抑制HPV18E7基因的表达，同时具有较低的毒副作用，可用于制备抑制HPV18E7基因表达的药物。
【IPC分类】C12N15/113, A61P35/00, A61K48/00, A61P31/20
【公开号】CN105441446
【申请号】CN201410505064
【发明人】汤涛, 钟国衡, 邓艳, 陈娇, 蔡光伟, 黄志超, 万力, 毕宏伟
【申请人】中國香港貝億生物科技有限公司
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2014年9月26日...