miR528的调控位点及其应用
【专利说明】
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技术领域： 本发明涉及植物育种，具体涉及水稻miR528编码基因及miR528调控位点 (0s06g06050、0s06g37150、0s08g04310、0s08g42640 和 0s07g38290)在培育生育期适宜和 高抗病毒能力的作物品种中的应用。
[0002] 技术背景： 开花时间（或谷类作物中的抽穗期）是植物从营养生长到生殖生长转变的过程，为了成 功繁衍，植物需要在极端环境(如高温、冷冻等）到来之前开花并完成其生活史。因此，开花 时间直接决定着植物能否在其生长地域完成生活史，同时也是决定作物产量的重要农艺性 状之一。培育生育期适宜的作物品种，也是作物育种过程中需要考虑的重要因素。以粮食 作物水稻为例，水稻是典型的短日照植物，即短日照促进水稻抽穗而长日照延迟其抽穗。现 在栽培稻和野生稻（ft 1^々>〇职/7)被认为起源于共同的祖先，野生稻分布在中国南部到印度 东部等低纬度地区，其分布纬度的极限是北纬28° ;而与其相对应的是，现在栽培稻的适应 范围已经大大扩展，目前在北纬45°附近仍有栽培稻的分布。说明随着人类育种过程中的 不断驯化，水稻的适应地域被大大扩展，从而更好地满足人类的粮食需求。由于不同地域的 纬度不同，作物开花时间亦会受到影响，为了实现作物产量最大化，选育生育期适宜的品种 显得尤为重要。因此，阐明植物尤其是粮食作物开花时间的分子机制，分离控制其开花时间 的基因，进而应用于指导分子育种和品种改良具有重要意义。
[0003] 病虫害是影响植物正常生长和农作物产量的重要因素，因此，病虫害的防治一直 是农业生产的重要环节。在病虫害的防治过程中，现代农业面临着巨大的矛盾：一方面，农 药使用在保障农作物稳产中功不可没，另一方面，过度使用农药也给环境及食品安全带来 极大风险。研究植物自身抗病虫害机制，发掘自然界中植物抗病虫害基因资源，进而指导作 物抗病虫害的分子育种，对于保障农作物稳产和食品安全、保护生态环境、维持农业可持续 发展有着重要意义。水稻条纹叶枯病毒（RSV)是一种由灰飞虱传播的RNA病毒，由其引起 的水稻条纹叶枯病（rice stripe)是一种常见水稻病害，在流行年份能造成水稻的严重减 产。水稻条纹叶枯病的发病植物往往表现出矮化，分蘖减少，发病早的心叶卷曲下垂，呈"假 枯心"症状；发病晚的虽只在剑叶或叶鞘上有退色斑，但穗发育不良或畸形，形成"假白穗"。 水稻条纹叶枯病最早于1931年在日本发现，我国最早于1964年报道，随后发病地区和面积 明显扩大，在80-90年代一直是水稻重要病毒病害。自本世纪初以来日趋严重，2004年仅江 苏省发病面积就达到133万hm 2,随后在全国范围内大面积流行。根据全国农技推广中心的 病害测报，该病发病面积连续5年一直在不断扩大，2008年达到200万hm 2。
[0004] miRNA和siRNA的研究是近年来国际生命科学研究的热点之一。具有调节功能的 非编码小分子RNA是指长度为21-24 nt左右，大多在进化上具有序列保守性的RNA分子。 它们不编码蛋白质，而是以RNA的形式在转录后水平上通过降解mRNA或抑制其翻译，参与 调节真核生物染色体结构的维持、防御病毒及调控生长发育等过程。小分子RNA的发现不 仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识，特 别是miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，小分子RNA在2002和2003连 续两年被《Science》杂志评为"年度十大科技进展"。
[0005] 大量的实验证据表明miRNA在动植物的生长、发育、环境适应等各个生物学过程 中具有重要的调控作用。在植物体内，miRNA通过序列互补的方式识别靶mRNA，进而指导靶 mRNA的降解或抑制其蛋白质的翻译，从而负调控靶位点的表达。虽然小分子RNA在理论上 的研究已经取得了巨大的进步，但是如何在生产上利用小分子RNA，为现代农业服务，产生 经济价值是现代生物领域的一大难题。本发明通过对miR528生物学功能的研究，发现其在 水稻抽穗期和抗病毒上具有重要调控作用，并通过调节miR528表达水平影响水稻抽穗期 及抗病毒特性，因此，本发明对于重要粮食作物水稻在抽穗期和抗病毒两个重要农艺性状 的改良具有重要的意义。
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【发明内容】
： 1、本发明证实miR528能够同时调控多个靶mRNA表达而发挥生物学功能。通过在水 稻中过量表达miR528使水稻抽穗时间提前，并且对水稻条纹病毒RSV表现出超敏感；而 miR528表达被下调的水稻植株则会表现出抽穗时间延迟和强抗RSV病毒能力。通过系统研 究，我们发现miR528在水稻抽穗期和抗病毒方面有着重要调控功能。
[0007] 2、本发明分析了 基因位点在不同水稻品种中的多态性，发现上游 启动子调控区域存在两段明显的插入(或缺失)序列，而且这种多态性对于成熟miR528的表 达量有重要调控作用。因此基因位点在不同水稻品种中的多态性可以在遗传育种 过程中作为分子标记，应用于水稻抽穗期和抗病毒两个重要农艺形状的筛选。
[0008] 3、本发明在玉米、高粱、甘蔗等重要禾本科作物中检测到miR528保守存在，说明 miR528对禾本科植物开花时间和抗病毒能力的调控广泛存在。因此，基因可以作为 分子标记应用于上述几种农作物的遗传育种过程中。
[0009] 本发明所提供的水稻基因及其上游调控序列具有以下特性： 1、序列表中的SEQ ID N0:1 序列表中的SEQ ID NO: 1由水稻基因及其上下游调控序列共3154个脱氧核糖 核苷酸组成。序列1中自2149位至2800位脱氧核糖核苷酸为基因转录序列，其余 部分为上下游调控序列。
[0010] 2、本发明涉及的#_/沿这$>基因序列以及受到成熟miR528调控的靶位点序列在分子 育种标记、转基因株系、转基因新品种中的应用均属于保护内容。
【附图说明】
[0011] 图1所示是miR528在水稻中的调控位点。miR528在水稻有5个靶mRNA，分别由 基因 0s06g06050、0s06g37150、0s08g04310、0s08g46240、0s07g38290 转录而成。miR528 的 识别位点是长度约为21nt的核苷酸序列，图中显示了 miR528与靶mRNA在对应的识别位点 存在序列的反向互补。
[0012] 图2所示的是miR528过量表达载体图谱。MIR528基因序列在组成型启动子 ACTIN1启动子的驱动下，连入到双元表达载体pCAMBIA2300。利用该载体转化野生型水稻， 进而在水稻中过量表达miR528。
[0013] 图3所示的是miR528过量表达和敲除水稻株系中成熟miR528表达量鉴定。A所 示的是小RNA Northern杂交显示mir528突变体及其野生型对照Dongjin中miR528的表 达水平，U6和5s RNA作为内参。B所示的是小RNA Northern杂交显示3个独立的miR528 过表达转基因系和其野生型对照中miR528的表达水平。
[0014] 图4所示的是北京田间miR528过量表达和敲除水稻株系抽穗期表型。结果显示 相对也其野生型对照，mir528突变体表现出晚花，而miR528过表达转基因植株则表现出早 花。
[0015] 图5所示是miR528过量表达水稻株系接种RSV病毒后的表型。Mock为未接种病 毒的对照植株，相对于野生型对照，miR528过量表达水稻株系对RSV表现出强敏感表型。
[0016] 图6所示的是MIR528基因上游调控区在不同品种中存在的序列插入(或缺失)。通 过对来自不同水稻品种的MIR528基因及其顺式调控序列分析，我们发现来自不同品种的 MIR528上游调控区域序列存在两种不同的等位形式（MIR528-A1和MIR528-A2)。其中相对 于MIR528-A1来说，MIR528-A2转录起始位点上游-590bp和-837bp位点分别存在30bp和 38bp的序列缺失。
[0017] 图7 miR528表达水平在不同水稻品种中存在差异。含有MIR528-A1等位基因的水 稻品种中miR528的表达水平整体高于含有MIR528-A2等位基因的水稻品种。其中miR156、 miR172、U6和5s RNA作为内参 图8水稻MIR528基因在单子叶植物中的保守性。利用水稻miR528前体序列（形 成miR528前体茎-环结构的序列）通过序列比对的方式搜索了植物转录组装数据库 (http://plantta. jcvi. org/)。比对结果显示，miR528前体在玉米、高粱、甘鹿等禾本科作 物中保守存在，尤其是在成熟miR528及其星号链（miR528*)区域高度保