及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于油菜分子育种技术领域。更具体涉及一种甘蓝型油菜核不育基 因 Bnms4b，同时还涉及一种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4b的制备方法，还涉及一种甘 蓝型油菜核不育基因 Bnms4b的应用。本发明涉及的一个和雄性不育相关的复等位位 点：Bnms4a为恢复基因，Bnms4 b为不育基因，Bnms4 e为空等位基因，其显隐性关系为： Bnms4a>Bnms4b>Bnms4e。不育基因 Bnms4b的克隆、验证和应用不仅可以加快甘蓝型油菜的隐 性细胞核雄性不育系和临保系的选育，而且以此为基础可以创建其他十字花科植物的核不 育系统，例如，将不育基因 Bnms4b转化到拟南芥中可以获得稳定的不育材料，并且这种不育 材料可以被BnMs3稳定的恢复。
【背景技术】
[0002] 油菜杂种优势利用关键在于优良的授粉控制系统和双亲之间是否可以获得具有 一定生产潜力的杂交种。优良的授粉控制系统主要有雄性不育，自交不亲和，化学杀雄等。 在甘蓝型油菜中以雄性不育应用得最为广泛。油菜雄性不育主要有细胞质雄性不育（CMS) 和细胞核雄性不育（GMS)。目前，世界上用于油菜杂种优势利用的CMS系统有ogu、kos、tour 和波里马。其中，波里马CMS是目前国际上公认的最有实用价值的CMS系统（傅廷栋，杂交 油菜的育种与利用，湖北科学技术出版社，2000)，虽然波里马在目前的油菜育种应用中占 有重要的地位，但是细胞质雄性不育的自身缺点并没有被完全克服，主要表型为育性受温 度影响较大，不稳定，恢复系来源较为狭窄，容易产生不良的胞质负效应，制种风险较大，其 应用受到了一定程度的限制。
[0003] 相对于油菜细胞质雄性不育系统，隐性细胞核雄性不育系统有诸多天生的优点， 主要表现为败育彻底，育性稳定，恢复源广，无不良胞质负效应，且有的核不育类型能获得 全不育制种群体而具有良好的应用前景。S45A(潘涛等，1988)和117A(侯国佐等，1990) 是两对隐性基因控制的核不育系的典型代表，由其选育而来的杂交种中已审定的有"蜀杂 6号"、"蜀杂7号"、"油研7号"、"油研8号"和"油研9号"等，该系统主要缺点是不育系 中存在50 %的可育株，在制种时需要在初花期拔掉50 %的可育株，由此不仅增加了制种的 成本，而且往往由于可育株清除不彻底，影响制种纯度，增加了生产的风险。本课题组克隆 了 S45AB系统的恢复基因 BnCYP704Bl，并将该基因及其育种应用申请了专利保护（涂金 星等，2009)，提出了利用花粉发育特异时期的启动子与致死基因 Bax相连，再连恢复基因 BnCYP704Bl的智能核不育系统的创建思路：花药发育的时期，致死基因表达，将含有恢复 基因 BnCYP704Bl的花粉粒杀死，存活的只有隐性不育的花粉粒，用来大面积繁殖不育系， 获得100%的不育群体，为隐性核不育的育种应用提供了新的思路。另外，美国和加拿大利 用烟草的TA29基因的启动子和核糖核酸水解酶（barnase)基因构建成融合基因转化甘蓝 型油菜，人工创造了新的核不育材料，并通过向该材料中导入抗除草剂基因后达到了机械 化作业。但是该系统的不足之处是必须对不育系和恢复系都进行转基因，该系统目前也受 到专利的保护。这些创新性的育种系统的构建，说明了隐性核不育在油菜育种中具有广阔 的前景，也说明了隐性核不育是未来油菜育种的主导系统。
[0004] 另一种类型的隐性核不育系统主要有9012A(陈凤祥等，1998)和7365A(Huang et al.，2007)，它们均属于隐性上位互作核不育类型，Zu等（2010)通过定性的遗传分析 和基因定位将它们的遗传模式修正为两个位点控制的复等位遗传模式，一个位点是BnMs3/ Bnms3,另一个位点是复等位位点Bnms4a>Bnms4b>Bnms4 e Xia et al.，2012)。本课题组克隆 了 BnMs3基因 （Dun et al.，2011)，根据其拟南芥的同源基因将其命名为BnaC.Tic40,并申 请了该基因以及其育种应用专利保护（涂金星等，2011)。由于该系统特殊的遗传模式，育 种家可以直接将临保系与不育系杂交获得100%的全不育系群体，而不需要拔出50%可育 株，大大节省了制种成本。用该系统选育的品种中，已审定的杂交种有"皖油14号"、"皖油 18号"（陈凤祥等，2002 ;2003)和"沪油杂1号"（孙超才等，2004)等等，临保系的成功选 育是油菜隐性核不育系统在育种研究领域取得的重大进展。但是这个系统遗传基础复杂、 临保系选育困难，不利于选育强优势组合。克服这些缺点的可行性策略是建立不育恢复基 因和上位基因的分子标记体系，进一步克隆Bnms4 a>Bnms4b>Bnms4e这三个复等位基因，利用 分子标记实现不育系和临保系的定向选择。同时，对这三个复等位基因的克隆，有助于更清 楚地了解隐性核不育的机理，为更好地应用这一极具潜力的育种系统提供帮助。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4b，该基因来自于 甘蓝型油菜，为一个显性的细胞雄性核不育基因，可以使多种植物产生雄性不育的表型，该 雄性不育具有败育彻底，无不良胞质负效应的特定，可以用于植物的杂种优势利用，利用 Bnms4b基因使临保系（基因型为Bnms3ms3ms4ems4e)变为不育，或作为核不育系，恢复系和 临保系选育的分子标记，以加快甘蓝型油菜核不育系和临保系的选育，或使用这两个基因 构建其他十字花科植物的核不育系统，用于杂交育种。
[0006] 本发明的另一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4l^制备方 法，方法易行，操作简便，利用本发明保护的基因的序列可以直接设计克隆该基因的引物， 实现快速制备克隆该基因的目的，具有经济，有效的特点。
[0007] 本发明再一个目的是在于提供了一种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4b在甘蓝型油 菜的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，将该基因克隆到各种载体中，并加以利用，同时还 可以利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效 和准确的特点。
[0008] 为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：
[0009] -种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4b的制备方法，其步骤是：
[0010] A、利用该基因的⑶S核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，启动子核苷酸序列 如SEQ ID N0. 2所示，或者编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID N0. 3设计开发出能扩增出 该基因的引物，并送引物合成公司合成，或者合成探针。
[0011] B、利用合成的引物，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，从基因组、mRNA 和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核 苷酸。也可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的 基因或同源基因。
[0012] 通过以上技术克隆了该基因，将该基因克隆到表达载体中，转化甘蓝型油菜7365C 以及野生型Col-Ο型中均可以导致稳定彻底的雄性不育（图7,图8)，这种雄性不育可以被 BnMs3恢复。这样的一个育性转换系统可以用于植物的杂种优势利用中。
[0013] 申请人通过分离和克隆技术，从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜隐性 核不育基因 Bnms4b，其⑶S序列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列。该基因的启动子一种分 离甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b，其⑶S序列为SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。该 基因编码的蛋白质一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b，其序列为SEQ ID N0. 3所 示的氨基酸序。
[0014] 可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明 的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因 组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的 一段多核苷酸。通过上述技术方案获得了二个核苷酸序列和一个氨基酸序列，将基因克隆 到载体中获得含有该基因的遗传转化载体，利用农杆菌介导的遗传转化将其转化到野生型 Col-Ο型拟南芥和油菜7365C中，都可以获得雄性不育的表型（图7和图8)。该基因编码 的蛋白质可能是通过引起绒毡层质体的功能异常，导致的雄性不育（图9)。
[0015] -种甘蓝型油菜核不育基因甘蓝型油菜以及其他十字花科植物的细胞 核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：
[0016] A、本发明为甘蓝型油菜细胞核雄性不育遗传改良提供了新用途，利用该基因的 ⑶S核苷酸序列如序列表SEQ ID NO. 1所示，启动子核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示，或者 编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID N0. 3设计开发出能扩增出该基因的特异引物；
[0017] B、进