s4b 编码的蛋白质的氨基酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的 不育株7365A。
[0053] 实施例2 :不育基因 Bnms4b的分离和功能验证
[0054] -种甘蓝型油菜核不育基因甘蓝型油菜以及其他十字花科植物（以拟 南芥为例）的细胞核雄性不育遗传改良中的应用，其步骤是：
[0055] 1. Bnms4b候选基因的确定与拟南芥油菜转化实验
[0056] 本实施例中采用的序列比对的程序来自白菜Chiifu-401的基因组网站提供的 Blast (http://brassicadb. org/brad/blastPage. php)软件，对包含 BAC 克隆 B107的序列进行分析，从中预测了 1个候选基因 CC2。通过BAC序列比对分析其他同源基 因的CDS序列初步确定候选基因 CC2的0RF起始终止位点，开发引物扩增出目标基因的CDS 序列，利用 RACE(rapid amplification of cDNA ends)技术得到 CC2 基因的 5'UTR 区域 和 3' UTR 区域（图 4) (GeneRacer ? kit, For full-length, RNA ligase-mediated rapid amplification of 5'and3'cDNA ends(RLM-RACE)，Catalog nos. L1500-01;L1500_02; L1502-01 ;L1502-02,来自Invitrogen公司）。对CC2基因序列进行酶切位点分析，发 现其可以不被ΚρηΙ和Sail酶切。设计扩增基因全长的引物CC2F(R)，左右引物分别加 上Sail和ΚρηΙ的酶切位点，利用高保真PCR聚合酶（Phusion? High-Fidelity DNA Polymerse,来自New England Biolads公司）分离基因全长8164bp的序列，将扩增片段 克隆到pCAMBIA2300(华中农业大学作物遗传改良国家实验室林拥军教授赠送）载体上， 测序结果表明序列完全准确，没有错配碱基存在。提取插入片段序列正确的克隆的融合质 粒，并转化大肠杆菌DH5 α (购自北京全式金公司），在含有50 μ g/ml卡那霉素的LB培养 基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，酶切检测准确的克隆所包含的载体就是包含正确 CC2全长的融合载体pC2300-CC2 (pCAMBIA2300+Bnms4b)(图5)。将载体质粒通过电转化的 方法转导GV3101农杆菌菌株中（本实验室长期保存的菌株），在含有50 μ g/ml卡那霉素 和50 μ g/ml庆大霉素的固体培养基上挑取单克隆，并进行PCR检测确认阳性克隆后，将该 单克隆于_80°C保存起来，用于Col野生型拟南芥的遗传转化。构建的Bnms4l^选基因 CC2 全长载体用农杆菌花序蘸染法转化Col拟南芥野生型植株（Zhang et al.，2006, Nature Protocols, 1:641-646)。在含25mg/L卡那霉素的1/2MS培养基上筛选转化拟南芥植株的种 子，抗性植株根长，子叶和真叶长势较大；非抗性植株根很短，植株矮小，子叶黄化（图6)。 植株长到2-4片真叶后移植到土中培养，得到30多株抗性植株。提取阳性植株提取叶片总 DNA (制备方法见 Stewart et al.，1993, 14(5) :748-749)，用 pCAMBIA2300 载体上存在的 NPT-II基因的CDS序列设计的引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。这30 多株经鉴定全部为阳性苗，并且全部表现为雄性不育（图7)，说明候选基因 CC2就是Bnms4b 基因，为显性的不育基因。
[0057] NPT-F (正向引物）：GCCACAGTCGATGAATCCAG，
[0058] NPT-R (反向引物）：ATGGTGGAGCACGACACTCT ;
[0059] CC2F (正向引物）：GCGGTACCAACCGAACTTTCATATAATCCGAATGGGGC，
[0060] CC2R (反向引物）：GCGTCGACATATCACCAGCACCAACAGTTTTCTTTTGC ;
[0061 ] 为了验证CC2在油菜中的功能，将同样的载体pC2300-CC2转化到甘蓝型油菜 7365C中。油菜遗传转化采用常规的农杆菌转化法（陈_等，2006;Cardoza and Stewart， 2003)。种子灭菌用70%浓度的酒精浸泡种子15min，0. 1%升汞消毒15min，20%~30% 的次氯酸钠消毒15min，无菌水清洗3次，每次间隔5min。将灭菌的种子播于Medium 0培 养基（配方见表2)，于25°C暗培养5d。在超净工作台内将获得的试管幼苗下胚轴切成 0.5cm_0· 8cm的小段，接种至含有农杆菌（悬浮过夜至对数生长期）的Medium 1上（配 方见表2)浸染25min-30min后，吸干液体，于25°C黑暗条件下共培养2d。将外植体转到 Medium 2上的愈伤组织诱导培养基（配方见表2)上，于25°C光照培养21d。在将外植体转 入Medium 3上分化培养基培养，每15-18d继代1次，直至分化出幼苗。当幼苗长出生长点 时，将幼苗生长点下端切断插入到Medium 4生根培养基上培养。转化植株生根后，种植于 混有腐殖土的细土纸杯中，保持70 %相对湿度，待根发育稳定后移栽到大田。
[0062] 提取阳性植株提取叶片总DNA(制备方法见：Stewart et al.，1993, 14 (5) : 748-749)，用引物NPT-F和NPT-R通过PCR进一步鉴定转化植株。用转基 因 T。代观察育性的表现，验证导入的候选基因的功能。结果显示在9株转基因 T。代植株 中，有6株表现为雄性不育（图8)。这6个植株同时伴随有叶片不同程度发黄的表型，该结 果再次证实CC2基因就是Bnms4 b基因。
[0063] 表2在遗传转化步骤中所用的各种培养基的配方
[0064]
[0065] 实施例3 :利用恢复基因 BnMs3和不育基因 Bnms4b构建十字花科植物（以Col-0 的野生型拟南芥为例）的不育材料和对应的保持材料
[0066] 利用Bnms4W以创建其他十字花科植物的细胞核雄性不育系统：白菜，甘蓝，拟南 芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用该基因可以导致稳定彻底的雄性不育的特点。
[0067] BnMs3基因被本小组成员申请了专利保护（涂金星等，2011)，为7365A的恢复基 因。结合此专利的成果，将含BnMs3基因的拟南芥转基因植株（可育，父本）和含Bnms4 bS 因的转基因植株（不育，母本）进行杂交，获得同时含有恢复基因 BnMs3和不育基因 Bnms4b 的Col拟南芥材料，将这样的单株自交后，发现有育性分离的情况。将分离群体中的不育株 和含有BnMs3的可育株杂交后继续出现育性分离，说明含有Bnms4l^拟南芥植株的不育性 可以被含有BnMs3的拟南芥植株保持下来。
[0068] 在本发明所提及的所有文献都在本申请中引用作为参考文献，就如同每一篇文献 被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明所讲述内容后，本领域的技术人员 可以对本发明做各种改动或者修改，这些等价形式同样属于本申请所附的权利要求书所限 定的范围。
【主权项】
1. 一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因汾胤?/，其⑶S序列为SEQIDNO. 1所示的核 苷酸序列。2. -种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因其序列为SEQIDNO. 2所示的核苷酸 序列。3. -种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因其序列为SEQIDNO. 3所示的氨基酸 序。4. 权利要求1至3任一项所述的一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因在甘蓝 型油菜细胞核雄性不育遗传改良中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种甘蓝型油菜核不育基因Bnms4b及制备方法和应用，其步骤：A、利用该基因的CDS核苷酸序列，或启动子核苷酸序列，或者编码的氨基酸序列设计开发出能扩增出该基因的引物，合成。B、利用合成的引物，从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因或任何感兴趣的一段核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。方法易行，操作简便，利用引物扩增该基因，将其克隆到各种载体中，转化到甘蓝型油菜可导致稳定彻底的雄性不育并进行育种利用，利用该基因本身的序列设计特异引物，用于分子标记辅助选择，具有快速，经济，有效和准确的特点。
【IPC分类】C12N15/84, C07K14/415, A01H5/00, C12N15/29
【公开号】CN105441456
【申请号】CN201510067850
【发明人】涂金星, 夏胜前, 文静, 易斌, 马朝芝, 沈金雄, 傅廷栋
【申请人】华中农业大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年2月9日