一种嵌合核酸分子及其在人源化抗体制备中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，主要涉及一种核酸分子及其在人源化抗体制备中的应 用。
【背景技术】
[0002] 抗体是一类重要的生物医药制品，在人类疾病的预防和治疗过程中发挥了重要的 作用。治疗性抗体的发展经历了鼠源抗体、嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化 抗体等不同的发展阶段。
[0003] 全人源化抗体(Full Humanized Antibody)，是指经过基因改造或转基因动物免 疫而获得的与人源抗体蛋白质序列完全一致的抗体。全人源化抗体由于不含动物蛋白，因 此副作用较低，作用效果更好，已成为当前和未来抗体工程的主要研究和发展方向。目前全 人源化抗体主要由噬菌体展示技术和转基因动物技术生产而来。2002年，第一个由噬菌体 展示技术生产的全人源化抗体Adalimumab(Humira)上市。2006年，第一个由转基因动物来 源的全人源化抗体Panitumumab在美国和欧洲批准上市。
[0004] 菌体展示抗体(Phage Display-generating Antibody)技术生产全人源化抗体 相对简单，技术相对成熟，但受抗体库容量和抗体翻译后修饰及有效折叠的影响，利用该技 术获得高亲合力抗体的难度很大。
[0005] 转基因动物全人源化抗体(Transgenic Humanized Antibody)是指将人类免疫球 蛋白基因全部或部分通过转基因或转人工染色体技术，转移至动物基因组中[动物内源的 抗体基因缺失(或失活）]，使动物表达人类抗体，从而获得全人源化抗体。利用转基因动物 生产全人源化抗体的最大优势是获得高亲合力抗体的机率较大，同时利用一种转基因动物 品系可针对不同的抗原生产不同类型的抗体，无需像噬菌体展示技术，针对不同的抗原，每 次都要重新构建噬菌体库。但随着研究的深入，发现转入的人类免疫球蛋白基因片段虽然 能在动物体内重排和表达，但其产生人抗体蛋白的性能要低于未经基因改造前的动物自身 抗体生产效果。以小鼠为例，其原因主要是当抗体在B细胞发育的初级阶段作为B细胞表面 受体(BCR)时，其与鼠源的信号蛋白Iga和IgP的相互作用并不是最优的（即鼠源BCR与鼠源 的I ga和IgP或人BCR与人的Iga和I 相互作用效果是最好的），因此影响了抗体的类型转 换、亲和力成熟和B细胞发育为成熟的生产抗体的浆细胞。为克服这一难题，Lee等(Nature biotechnology，2014;32(4) :356-363)将三个人免疫球蛋白基因（IgH，IgK和IgA)的可变区 替代小鼠的免疫球蛋白可变区，而恒定区使用小鼠免疫球蛋白的相应片段，利用这种策略 可克服上述提到的问题，获得可变区为人源，恒定区为鼠源的嵌合抗体，再通过下游的改造 将鼠源的恒定区改造为人源的恒定区，得到全人源化抗体。这种方法存在的缺点是需要进 行二次改造才能获得全人源化抗体。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种核酸分子，可以高效的制备全人源化抗体，其克服了 不同物种BCR与Iga和Ig0相互作用的不兼容性问题，同时相对Lee的方法，其表达的人源化 抗体无需进行二次改造。
[0007] 本发明的目的是通过以下措施实现的：
[0008] 本发明提供了一种核酸分子，包括了人免疫球蛋白基因或其片段，以及宿主动物 IgM恒定区的基因片段(即IgH Cy的基因片段）。
[0009] 优选的，上述宿主动物IgM恒定区的基因片段位于（替代)人免疫球蛋白IgM重链基 因的相应恒定区。
[0010] 上述宿主IgM恒定区基因片段为宿主动物IgH Cy的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和 TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列。人CH1序列与人Ig轻链结合，保证抗体结 构，CH2部分区又保证人和小鼠 C区正常转录和翻译。当宿主为鼠时，用于取代的鼠 IgM恒定 区基因片段如SEQ ID NO.1的〈1>~〈4425〉所示;被鼠源IgM恒定区基因片段替代的hlg序列 如SEQ ID N0.2所示。当宿主为猪时，用于取代的猪IgM恒定区基因片段如SEQ ID N0.3的〈1 >~〈4386>所示，被猪源IgM恒定区基因片段替代的hlg序列如SEQ ID NO.4所示。
[0011]上述核酸分子中宿主动物IgM恒定区的基因片段的结构及其与人免疫球蛋白IgM 基因或其片段的连接结构如图1-1所示。进一步地，上述核酸分子还可以包括FRT序列、人Ig 内含子序列（如hIgM、hIgD);所述核酸分子中宿主动物IgM恒定区的基因片段与人免疫球蛋 白IgM基因或其片段，以及与FRT、人Ig内含子(如IgM、IgD)的连接结构如图1-2所示。当宿主 为鼠时，所述FRT序列如SEQ ID N0.1〈4426>~〈4459〉，人Ig内含子序列包括SEQ ID N0.1〈 4460〉~〈4717〉；当宿主为猪时，FRT序列如SEQ ID NO. 3〈4387>~〈4420〉，人Ig内含子序列 包括SEQ ID Ν0·3〈4421>~〈4678〉。
[0012] 例如，具体地，人IgM的CH1和部分CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和 TM2序列以及其之间的序列和相关PolyA信号序列，与FRT、IgD内含子、人的IgHG3的调控区 (Sy3)和IgHG3CHl序列依次链接，形成一个表达嵌合人小鼠 IgM和人IgG的基因载体(如图 1-3)。或者，人IgM的CH1和部分CH2序列，小鼠的CH2部分序列、CH3、CH4、TM1和TM2序列以及 其之间的序列和相关PolyA信号序列，与FRT、IgM内含子、人的IgD3的调控区（SS3)和IgD3 CH1序列链接，形成一个表达嵌合人小鼠 IgM和人IgD的基因载体(图1-4)。
[0013] 上述人免疫球蛋白基因包括了人免疫球蛋白重链基因的V区基因、D区基因、J区基 因。上述人免疫球蛋白重链基因还可以包括hCy、hCa、hCS和/或hC|重链基因和人的3'-调 控区(hLCR)等。
[0014]例如，上述核酸分子的基因簇如图2所示（黑框位置为导入的宿主动物的IgM恒定 区基因部分序列(片段)）。
[0015] 通过以上的改造，上述核酸分子在动物体内发育的早期阶段表达与宿主动物同源 的IgM，该IgM作为BCR，有利于与动物自身的Iga和I相互作用，促进抗体的类型转换为 IgG、亲和力成熟和B细胞发育。
[0016] -种表达载体，包含上述核酸分子。一种细胞，包含上述核酸分子或上述载体。一 种动物，如猪、鼠，包含上述核酸分子。一种人源化抗体，由上述核酸分子重排、编码制得。上 述核酸分子或载体或细胞在制备人源化抗体中的应用。上述核酸分子或载体或细胞在制备 转基因动物中的应用。
[0017] 将经过上述改造的人免疫球蛋白基因转入动物体内获得转人免疫球蛋白转基因 动物，或进一步与自身免疫球蛋白基因不表达的动物进行杂交获得只表达人抗体蛋白的基 因工程动物。利用抗原免疫转入人免疫球蛋白基因（重链、轻链）的动物，获得全人源化抗 体。例如：
[0018] 采用上述核酸分子或载体或细胞制备转基因动物的方法，包括以下步骤：
[0019] (1)所述核酸分子的获得；
[0020] (2)将所述核酸分子构建入载体；
[0021] (3)向宿主细胞(包括干细胞，诱导干细胞和体细胞)或胚胎导入含有所述核酸分 子的载体；
[0022] (4)将含有人Ig的细胞植入宿主动物的胚胎内（嵌合体制备)或体细胞克隆；
[0023] (5)繁育杂合、纯合的转人Ig基因的动物。（包括与宿主内源免疫球蛋白基因失活 的动物杂交）。
[0024] 上述宿主动物为哺乳动物，如鼠、兔、猪、牛、羊、鸡、马等。上述载体为人工染色体 (如酵母，细菌）、噬菌体、质粒等。上述载体导入宿主细胞的方法，包括电穿孔、病毒感染、月旨 质体转染和显微注射等。
[0025] 本发明所述宿主动物的IgM恒定区的基因片段、CH2部分序列是指编码可结合宿主 动物信号蛋白Iga和/或Ig邱勺核苷酸序列。
[0026]有益效果
[0027] 1.本发明生产的全人源化抗体具有高亲和力。
[0028] 2.本发明可利用一种转基因动物品系产生不同类型的各种抗体，且本发明适用于 多种动物。
[0029] 3.本发明的宿主自身免疫球蛋白不表达或在检测限度以下。