玉米转录因子ZmMADS47基因及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玉米转录因子ZmMADS47基因及其应用。
技术背景
[0002]玉米(Zeamays)是世界上种植面积最大并且产量最高的禾本科作物之一，大多用于动物饲料，食物以及工业原料，在工农业中均有着广泛的应用。玉米对于现代社会的发展起到了重要作用。但玉米蛋白质中必需氨基酸含量不完整，尤其是胚乳中含量最高的储藏蛋白醇溶蛋白中赖氨酸和色氨酸严重缺乏。有研究表明，低含量的醇溶蛋白以及粉质的胚乳会增加非醇溶蛋白的积累，从而显著改善玉米籽粒中蛋白质的营养品质。
[0003]0paque2 (02)是一个含有bZIP结构域的转录因子。在生化成分中，o2突变体籽粒相对野生型表现出了粉质的胚乳以及低含量的醇溶蛋白，因此其赖氨酸和色氨酸积累量较野生型有大幅提高。所以，o2是一个著名的籽粒高赖氨酸突变体。目前研究表明，转录因子0paqUe2可以调控绝大部分醇溶蛋白的表达。从02克隆至今，人们找到了一些和02互作的蛋白，如:？8?、0即1/0即2、60肥，211^&1丨1丨11等。但是对于02在玉米籽粒发育中具体的调控机制依然未得到完全解析。
[0004]鉴于02本身转录因子的分子结构以及其调控的下游蛋白在玉米籽粒中的重要作用，人们普遍认为02是一个在籽粒发育中起到重要作用的转录因子。寻找其他与02互作的蛋白从而进一步解释醇溶蛋白调控网络对于人们改进玉米蛋白品质具有极为重要的意义。一般来讲，研究蛋白互作的方法包括酵母双杂，Pu 11-down以及免疫共沉淀(Co IP)等实验。
[0005]酵母双杂实验是基于酵母体系筛潜在互作蛋白的方法。该实验可以大范围地筛选出可能存在直接互作的两个蛋白。但其背景信号较高，会有一些假阳性情况出现。
[0006]Pull-down与免疫共沉淀是基于免疫沉淀和Western技术发展来的体外以及体内检测蛋白互作的技术。该技术通过抗体的特异性吸附以及互作蛋白之间的相互物理性结合来进行互作验证。该实验方法相对于酵母双杂可以大幅降低背景。
【发明内容】
[0007]本发明的目的之一在于提供一种玉米转录因子ZmMADS47基因。
[0008]本发明的目的之二在于提供玉米转录因子ZmMADS47基因的应用。
[0009]为达到上述目的，本发明具体涉及到的方面为:
一种玉米转录因子ZmMADS47基因，其特征在于所述基因为SEQ ID NO:1所示的碱基序列。
[0010]—种载体，其特征在于该载体含有根据权利要求1所述的玉米转录因子ZmMADS47基因。
[0011 ] 一种质粒，其特征在于该载体含有根据权利要求2所述的载体。
[0012]一种克隆上述的玉米转录因子ZmMADS47基因的方法，其特征在于该方法的具体步骤为:首先获得均一化的玉米籽粒cDNA片段，将该cDNA片段与双杂载体pGADT7-Rec连接转化，获得了约1.0 X 16个克隆，选取了包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域的02-2片段，将其连入PGBK-T7载体中，通过PEG/LiAc法将构建的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到16个酵母转化子，通过DDO与QDO的筛选，共获得了50个疑似阳性克隆，对这些克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与水稻0sMADS47同源的基因ZmMADS47。
[0013]一种上述的玉米转录因子ZmMADS47基因与0paque2基因相互作用在RNAi转基因沉默过程中的应用。
[0014]一种上述的玉米转录因子ZmMADS47基因与0paque2基因相互作用在下调玉米种19kD醇溶蛋白，22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白含量中的应用。
[0015]通过Pull-down和coIP实验明确了ZmMADS47和02在体外和体内都能相互作用。
[0016]通过醇溶蛋白抽提实验以及对醇溶蛋白基因的定量PCR实验证明了该基因在转基因沉默后会导致19kD醇溶蛋白、22kD醇溶蛋白以及50kD醇溶蛋白的表达下降。
[0017]本发明通过RNA干扰的方法获得一个02互作蛋白ZmMADS47的基因沉默转基因玉米材料，并通过醇溶蛋白抽提，透射电镜观察等对转基因材料进行表型分析。通过透射电镜观察证明了该基因在转基因沉默后会导致细胞内蛋白体体积变小并且不规则。
[0018]本发明首次发现植物MIKC类的MADS-box转录因子ZmMADS47能够和bZIP类的转录因子02发生互作，并且能够影响醇溶蛋白表达，在细胞学上对蛋白体的形状产生影响。为高品质玉米的大规模生产奠定理论基础。
[0019]本发明首次发现与02产生蛋白互作的ZmMADS47是一个转录因子，并且能够直接结合部分醇溶蛋白启动子，令02释放ZmMADS47的转录激活能力，一同调控部分醇溶蛋白的表达。这对于解释02的具体转录后调控机制具有极为重要的意义，为o2突变体在农业上的应用提供了新的应用方向。
【附图说明】
[0020]图1是酵母双杂筛库中t耳质粒构建的示意图。由于0paque2本身就是一个转录因子，具有较强的转录激活能力，所以利用0paque2全长基因筛库会有很高的自激活背景。因此，根据Opaque-2的序列特性，将0paque2全长分为三段，选择第二段02-2(即包括了bZIP结构域又屏蔽了转录激活结构域)作为饵，和已经成功构建的库质粒进行筛库；
图2是酵母双杂筛库获得的阳性克隆滴板验证结果图。
[0021 ] 图3是通过GST ?1111_(10￥11实验验证2111140347与(^^1162的相互作用。
[0022]图4是通过免疫共沉淀(coIP)实验验证ZmMADS47与0paque2的相互作用。
[0023]图5是ZmMADS47转基因RNAi载体构建示意图。
[0024]图6是ZmMADS47 RNAi各个阳性事件籽粒中ZmMADS47在cDNA水平的表达量检测。
[0025]图7是ZmMADS47 RNAi 3号与6号事件籽粒中ZmMADS47在蛋白水平的表达量检测。
[0026]图8是ZmMADS47RNAi 3号与6号事件中总蛋白、醇溶蛋白和非醇溶蛋白的定量检测。
[0027]图9是ZmMADS47 RNAi 3号与6号事件中醇溶蛋白抽提的SDS-PAGE检测。
[0028]图10是ZmMADS47 RNAi 3号与6号事件中醇溶蛋白抽提的western blot检测。
[0029]图11是ZmMADS47RNAi 3号与6号事件种子的形态特征。虽然醇溶蛋白在这两个事件中有显著变化，但是却并没有使籽粒的外观发生明显变化。
[0030]图12是ZmMADS47 RNAi 3号事件未成熟种子的透射电镜观察。
[0031]图13是利用酵母转录激活体系对ZmMADS47全长以及各个分段的转录激活能力进行测试。
[0032]图14是ZmMADS47全长及各分段的亚细胞定位分析。
[0033]图15是利用ZlA醇溶蛋白启动子对ZmMADS47的保守DNA结合序列进行筛选。
[0034]图16是对筛选出的ZmMADS47所结合DNA片段进行进一步筛选。
[0035]图17是对筛选出的ZmMADS47所结合CATGT结构域以及其周围碱基的突变扫描。
[0036]图18是对筛选出的ZmMADS47所结合CATGT结构域的冷探针竞争。
[0037]图19是02以及ZmMADS47对19kD、22kD以及50kD醇溶蛋白启动子的转录激活能力测试。
[0038]图20是对02的转录激活结构域进行缺失后检测其影响ZmMADS47调控zIA醇溶蛋白启动子起始转录能力的测试。
[0039]图21是对50kD醇溶蛋白启动子部分序列进行缺失后对02与ZmMADS47调控产生的影响进行测试。
【具体实施方式】
[0040]下面结合具体实施事例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆(Molecular Cloning: A Laboratory Manual ,3rd ed.)或植物分子生物学一实验手册(Plant Molecular B1logy—A Laboratory Manual, Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg, 1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0041 ]实施例一:利用酵母双杂实验筛选和02有互作的蛋白
首先采取了 SMART方法，获得了均一化的玉米籽粒cDNA片段。将该cDNA片段与双杂载体pGADT7-Rec连接转化，获得了约1.0X 16个克隆。在饵质粒的构建中，由于全长02转录背景较高，因此选取了包含bZIP结构域以及核定位信号又屏蔽了其转录激活结构域的02-2片段，参见图1，将其连入PGBK-T7载体中。
[0042]结果:通过PEG/LiAc法将构建的库质粒以及饵质粒转入酵母AH109中，得到16个酵母转化子。通过DDO与QDO的筛选，共获得了 50个疑似阳性克隆。对这些克隆质粒抽提、测序分析以及回转酵母，筛选出一个与水稻0sMADS47同源的基因ZmMADS47，参见图2。
[0043]实施例二:ZmMADS47和02的GST Pull-down蛋白互作验证。
[0044]I分别取20 yg含有GST_Z