一种葡聚糖外切酶ii基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系统的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程领域，具体涉及里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)基因密码 子优化及ρΡ I C9K-cbh2表达载体的构建。
【背景技术】
[0002] 纤维素酶是一类多组分酶的总称，能够将难以被生物利用的纤维素水解为利于被 生物利用的葡萄糖，因此被认为是潜力巨大的酶制剂之一。纤维素酶属于糖苷水解酶，能够 降解纤维素的纤维素酶系至少包括三类组分：内切型-β_葡聚糖酶（〇11(1 〇-1，4-0-〇-glucanase，EC3 · 2 · 1 · 4)，外切型-β-葡聚糖酶（exo-1，4-0-D_glucanase，EC 3 · 2 · 1 · 91)与β-葡萄糖苷酶(β_1，4-D-glucosidase，EC 3.2.1.21)。而纤维素主体由吡喃葡萄糖构成，并以 β_1，4糖苷键连接，形成大分子线性多聚物，单体为纤维二糖分子，主要由结构稳定、微生物 难以降解的结晶区和结构疏松、微生物容易降解的非结晶区两部分构成。
[0003] 纤维素酶系中的酶组分并不是单独作用于纤维素从而水解纤维素的，它们通过相 互协同作用实现水解功能，其中内切型-β_葡聚糖酶作用于非结晶区，水解β_1，4糖苷键，可 将线性纤维素多聚物截断生成大量纤维素小分子;外切型-β-葡聚糖酶水解l，4-i3-D-糖苷 键，作用于线性纤维素多聚物末端，生成纤维二糖分子;葡萄糖苷酶则将纤维二糖水解成 为葡萄糖。通过纤维素酶复合酶组分相互协同作用，可以将地球上最丰富的生物高聚物一 纤维素，转化为微生物可以轻易利用的葡萄糖，通过发酵产生生物燃料，用以缓解目前能源 短缺问题。
[0004] 纤维素酶来源广泛，产生纤维素酶的生物包括昆虫、软体动物、原生动物、细菌和 真菌。然而，这些自产酶天生具有一定的配比缺陷，比如:里氏木霉的纤维素酶中CBH II和 β-葡萄糖苷酶产量不足，而黑曲霉中各酶的分泌高峰期不同，这些因素对纤维素水解有限 制作用。另外，不同木质纤维素材料中纤维素、半纤维素以及木质素的比例有显著差异，导 致同一类商业纤维素酶制剂或自产酶并不能发挥最佳的酶解效果。所以，优化定制纤维素 酶，使各组分达到最佳配比，才能在最少酶用量时获得最优的水解效果。因此，为了优化定 制纤维素酶，获得纤维素酶单酶组分十分关键。
[0005] 近些年来，异源表达纤维素酶基因获得单酶组分是研究热点。毕赤酵母(Pichia pastoris)可以实现翻译后修饰作用，如糖基化、二硫键形成，使蛋白可以进行正确折叠，并 获得有活性的目标蛋白，另外，毕赤酵母并不产生内源性木质纤维素酶组分，且胞外蛋白成 分并不复杂，重组毕赤酵母菌发酵上清液甚至可以不经过纯化直接作为单酶制剂进行使 用，因此，以毕赤酵母作为宿主菌实现纤维素酶组分CBH II异源表达以获得CBH II组分。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种优化的里氏木霉CBH II基因，优化后的序列GC含量由 55.4%降低为41.5%，并构建pPIC9K-cbh2表达载体，以获得稳定高效的表达转化子。
[0007] 本发明提供的CBH II基因密码子优化及其毕赤酵母表达系统具体步骤如下：
[0008] 1、密码子偏向性优化：
[0009] 本发明对CBH II实现密码子优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] SEQ ID NO.1:
[0011]
[0013] 密码子优化前CBH II氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0014] SEQ ID NO.2：
[0015]
[0016] 本发明利用Gene Designer(DNA2.0，Menlo Park，CA，USA)实现对SEQ ID N0.1 所 示的CBH II核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0017] SEQ ID NO.3
[0018]
[0020] 经过密码子优化后，CBH II氨基酸序列与SEQ ID NO.2相同。
[0021] 2、表达载体构建：
[0022]以质粒pPIC9K作为载体，将优化后的CBH II基因插入启动子A0X1下游，5'端酶切 位点为EcoR 1，3'端酶切位点为Not I，构建pPIC9K-cbh2表达载体。
[0023] 3、获取重组菌株：
[0024]以Sac I作为pPIC9K_cbh2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，通过电转 化转入毕赤酵母。
[0025] 4、优化诱导产酶条件：
[0026]以BMMY作为产酶培养基，优化诱导剂量与培养基中磷酸钾缓冲液pH值，实现CBH II稳定高效产酶。
[0027]本发明有益效果：
[0028] 1、本发明实现了里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)基因密码子偏向性优化，偏向 对象为毕赤酵母菌，优化过程中降低了 GC含量，由55.4%降低为41.5%，提高重组毕赤酵母 菌表达效率。
[0029] 2、本发明对里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)基因密码子偏向性优化过程中，利 用RNA二级结构折叠软件RNAstructure对优化后的核苷酸序列实现二级结构折叠，并调整 碱基序列，使起始密码子端碱基呈开环结构，利于核糖体结合，提高重组毕赤酵母菌表达效 率。
[0030] 3、本发明构建了含醇氧型启动子A0X1的表达载体pPIC9K-cbh2,以甲醇作为诱导 剂，控制甲醇添加量，大幅度提高重组目的蛋白表达量。
【附图说明】
[0031] 图1:里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)密码子偏向性优化前后核苷酸序列对比 图。
[0032]图2:里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)密码子偏向性优化前后氨基酸序列对比 图。
[0033] 图3:表达载体pP I C9K_cbh2质粒图谱。
[0034]图4:核酸电泳检测表达载体pPIC9K_cbh2是否构建成功，其中：
[0035] 1号泳道是利用限制性内切酶EcoR I、Not I双酶切后所得条带；
[0036] 2号泳道是利用限制性内切酶Sac I单酶切后所得条带。
[0037] 图5:利用250mL三角瓶，装液量为30mL，甲醇添加量为0.5%，于220rpm，30°C下培 养120h后CM