C酶活检测结果。
[0038] 图6:利用500mL三角瓶，装液量为50mL，甲醇添加量为0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、 2.5%，于220rpm，30°C下培养192h后CMC酶活以及生物量检测结果。
[0039] 图7:利用500mL三角瓶，装液量为50mL，调节BMMY培养基中磷酸钾缓冲液pH为5.0、 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,于220rpm，30°C下培养192h后CMC酶活以及生物量检测结果。
[0040] 图8:利用500mL三角瓶，装液量为50mL，于220rpm，30°C下培养，每24h取样，对优化 培养条件前培养液与优化培养条件后培养液进行CMC酶活检测对比结果。
【具体实施方式】
[0041 ]下面通过实例对本发明进行详细阐述。
[0042] 实施例1:里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH II)基因密码子优化与表达载体构建。
[0043] 1、本发明利用Gene Designer(DNA2.0,Menlo Park,CA,USA)实现如SEQ ID NO. 1 所示的CBH II(NCBI Reference Sequence:XM_006962518.1)核苷酸序列密码子偏向性优 化，优化后核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。通过密码子优化后的氨基酸序列与原始氨基酸 序列一致，如SEQIDN0.2所示。以PichiapastorisGS115作为宿主，通过密码子偏向性优 化后核苷酸序列与原始核苷酸序列对比见图1，通过密码子偏向性优化后氨基酸序列与原 始氨基酸序列对比见图2。
[0044] 2、以5'端酶切位点为EcoR 1，3'端酶切位点为Not I作为双酶切位点，插入pPIC9K 质粒载体A0X1启动子下游，构建表达载体pPIC9K-cbh2,表达载体图谱见图3。并通过双酶切 对表达载体进行验证，以确定表达载体pPIC9K-cbh2构建成功，酶切后核酸电泳图见图4。 [0045]实施例2:线性化表达载体并进行电转化以及筛选高产菌株。
[0046] 1、以Sac I作为pPIC9K_cbh2表达载体线性化位点，实现表达载体线性化，核酸电 泳对线性化后的质粒进行验证，见图4。通过电转化转入Pichia pastoris GS115,获得重组 菌株，利用菌落PCR，将扩增条带清晰的菌落通过摇瓶发酵获得高产菌株，于120h时取样并 利用DNS法测定发酵上清液CMC酶活，见图5,其中，1个单位酶活单位定义为在50°C水浴条件 下，1分钟内能转化lwnol底物的酶量。
[0047]实施例3:优化诱导产酶条件。
[0048] 1、以BMMY作为产酶培养基，以甲醇作为诱导剂，分别以甲醇添加量0.5 %、1.0 %、 1.5%、2.0%、2.5%进行产酶，于192h处利用DNS法测定发酵上清液CMC酶活，并测定其菌体 浓度，优化结果见图6。
[0049] 2、通过调节BMMY培养基中磷酸钾缓冲液pH为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5进行产酶 优化，于192h处利用DNS法测定发酵上清液CMC酶活，并测定其菌体浓度，优化结果见图7。优 化后与优化前CMC酶活对比见图8。
[0050]
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【主权项】
1. 一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系统，其特征在于密码子 优化与表达系统构建的步骤如下： 1) 密码子偏向性优化:本发明利用软件GeneDesigner实现对SEQIDNO. 1所示的CBH II核苷酸序列密码子偏向性优化，优化后核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。 2) 表达载体构建：以质粒pPIC9K作为载体，将优化后的CBHII基因插入启动子A0X1下 游，5'端酶切位点为EcoRI，3'端酶切位点为NotI，构建pPIC9K-cbh2表达载体。 3) 获取重组菌株：以SacI作为pPIC9K-cbh2表达载体线性化位点，实现表达载体线性 化，通过电转化转入毕赤酵母。 4) 优化诱导产酶条件：以BMMY作为产酶培养基，优化诱导剂添加量与培养基中磷酸钾 缓冲液pH值，实现CBHII稳定高效产酶。2. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤1)中所指的CBHII是由如SEQIDNO. 1或SEQIDNO.3所示核苷酸序列所编码的 里氏木霉葡聚糖外切酶II基因。3. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤1)中描述的葡聚糖外切酶II基因密码子偏向性优化，优化后CBHII核苷酸序列 如SEQIDNO.3所示。4. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤1)中描述的葡聚糖外切酶II基因，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。5. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤2)中描述的表达载体，为pPIC9K-cbh2表达载体。6. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤3)中描述的重组菌株，是指含优化后cbh2基因的重组毕赤酵母菌。7. 根据权利要求1所述的一种葡聚糖外切酶II基因的密码子优化及其毕赤酵母表达系 统，其步骤4)中描述的重组毕赤酵母菌株能够稳定高效产葡聚糖外切酶II蛋白。
【专利摘要】本发明涉及来源于里氏木霉葡聚糖外切酶II(CBH？II)基因密码子优化及其毕赤酵母表达系统。本发明利用Gene？Designer(DNA2.0,Menlo？Park,CA,USA)对CBH？II(NCBI？Reference？Sequence:XM_006962518.1)进行密码子偏向性优化，构建了pPIC9K-cbh2表达载体，以Pichia？pastoris？GS115为宿主，通过电转化方法获得转化子。通过检测表明，经过密码子优化的CBH？II基因能够在毕赤酵母中稳定高效的表达，重组菌株CMC酶活0.14U/mL，发酵上清液蛋白含量0.15mg/mL。
【IPC分类】C12N15/56, C12R1/84, C12N15/81, C12N15/10, C12N9/42
【公开号】CN105441464
【申请号】CN201510801789
【发明人】孙付保, 白仁惠, 张震宇, 张云博, 王春迪
【申请人】江南大学
【公开日】2016年3月30日
【申请日】2015年11月19日