玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法
【专利摘要】本发明公开了一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，特点是LAMP的两对引物如下MCMV2-F3、MCMV2--B3、MCMV2-FIP、MCMV2-BIP，其RT-LAMP反应体系如下：2μL MCMV2-FIP溶液，2μL MCMV2-BIP溶液，0.25μL MCMV2-F3溶液，0.25μL MCMV2-B3 溶液，12.5μL 2×反应缓冲液，1μL Bst DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶混合液，1μL钙黄绿素，2.5μL RNA模板，无RNA酶的水补至25 μL，检测方法包括总RNA的提取；RT-LAMP引物的设计和合成；配制 RT-LAMP 反应体系；MCMV的RT-LAMP目视检测，优点是灵敏度高，特异性强且简便快速。
【专利说明】玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试 剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及玉米褪绿斑驳病毒的检测技术，尤其是涉及玉米褪绿斑驳病毒的环介 导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
【背景技术】
[0002] 玉米裡绿斑驳病毒（Maize chlorotic mottle virus，MCMV)属番爺丛矮病毒科 (Tombusviridae)玉米褪绿斑驳病毒属（Machlomovirus)，1974年首次在秘鲁发现，1976年 美国相继报道该病毒的发生，现在主要分布于美国、阿根廷、墨西哥及秘鲁等地。该病毒主 要通过昆虫、种子携带、机械传播等方式蔓延扩散。其中种子带毒是远距离传播的重要途 径，且种子传毒率与种子的质量无相关关系。甲虫和蓟马等昆虫是该病毒扩散的主要介体， 世界范围广泛分布的甲虫和蓟马为其快速传播提供了便利条件。该病毒侵染玉米所引发的 病害可导致玉米减产1〇°/『15%，若与玉米褪绿斑驳病毒、甘蔗花叶病毒或玉米矮花叶病毒复 合侵染，有可能造成平均高达75%的产量损失。鉴于MCMV的高风险性，我国在2007年颁布 的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》将其列为检疫性病毒。2009年，龚海 燕等从青岛口岸进境的美国大豆种子种混杂的玉米粒上检出该病毒，2011年，刘洪义等从 黑龙江口岸邮寄进境的德国玉米种子也检出该病毒。
[0003] 目前，玉米褪绿斑驳病毒的检测主要采用生物学、血清学和RT-PCR方法，这些方 法的弊端在于耗时长，依赖昂贵的检测设备。环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等2000年首先提出来的一种新的核酸扩增技术，该 技术依赖于能够识别靶序列上6个特异区域的引物和一个具有链置换特性的DNA聚合酶 (fci DNA polymerase),在等温条件下高效扩增祀基因，灵敏度和特异性高。该方法已应用 于病毒、类病毒、细菌、真菌及转基因的检测。而迄今尚无应用该技术检测玉米褪绿斑驳病 毒的报道。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种具有灵敏度高，特异性强且简便快速的玉 米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为： 1、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组，LAMP的两对引物序列如 下： 外侧上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 内侧上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 内侧下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
[0006] 2、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2X 反应缓冲液，由fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均为20 μ mol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶 液，I丐黄绿素突光染料(购自Eiken公司，商品名为Fluorescent Detection Reagent),所述 的2X反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游引物 溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料的体 积比为12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列为 内侧上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 内侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外侧上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ; 外侧下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGAITTTGAITTGG。
[0007] 所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、L 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ μ L。
[0008] 3、一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： (1) 总RNA的提取 将玉米待测样本使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取，具体操作见试剂 盒说明书； (2) RT-LAMP引物的设计和合成 从GenBank调出所有玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40 软件进行比对分析，找出MCMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件 PrimerExplorer V4设计特异性引物并通过引物筛选获得RT-LAMP检测的最佳引物： 外侧上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 内侧上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 内侧下游引物 MCMV2-BIP ：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG ； (3) 配制RT-LAMP反应体系 浓度为20 μ mol/L的内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2 μ L，浓度为20 μ mol/L的外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0.25 yL，12. 5 yL 2Χ反应缓冲液， 由DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液1. 0 μ L，钙黄绿素荧光染料 1.0 μ?，样品总 RNA2.5 yL，无 RNase 的水补至25 yL; (4) MCMV的RT-LAMP目视检测 将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：61°C 70 min，95°C 2 min;RT-LAMP扩增 结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产 物呈黄绿色，则样品感染玉米褪绿斑驳病毒。
[0009] 所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、I. 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，所述的 聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ μ L。
[0010] 原理说明：钙黄绿素是一种螯合剂，反应前与试剂中的锰离子结合处于淬灭状态， LAMP扩增反应的副产物焦磷酸离子与锰离子结合释放钙黄绿素，淬灭状态解除，发出黄绿 色荧光，通过观察荧光的有无可判断是否有扩增。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明首次公开了玉米褪绿斑驳病毒的环 介导等温扩增检测引物组、检测试剂盒及检测方法，根据玉米褪绿斑驳病毒（MCMV)外壳 蛋白基因序列的保守区设计RT-LAMP特异性引物，该引物组具有特异性强，灵敏度高达20 pg，与RT-PCR相当，而反应时间明显缩短，整个检测1小时内可完成，提高了扩增效率，这与 引物本身的质量(如长度、GC含量)、退火温度、反应体系中金属离子的浓度、酶的活性等因 素直接有关。通过在反应体系中预先加入螯合剂--I丐黄绿素，可实现肉眼观察判定结果， 尤其适合设备资源配置简单的口岸实验室开展现场快速筛查，具有较强的推广价值，其优 点如下： 1、 操作简单。RT-LAMP在60°C ~65°C恒温条件下进行，不需要复杂仪器设备，只需维持 恒温的水浴锅或金属浴就可完成。且可通过在反应液中加入钙黄绿素，反应结束后裸眼观 察颜色变化，判定结果，不需电泳仪和紫外观测； 2、 特异性高。该技术通过4条引物识别靶基因6段不同的序列，在很大程度上提高了 检测的特异性； 3、 高效灵敏。该技术在恒温条件下进行，不需通过温度循环实现基因扩增，且反转录可 与PCR-步进行，节约了时间。60分钟内DNA能扩增到10 9~101(1倍。其灵敏度与PCR相当。 因此，采用RT-LAMP技术检测MCMV非常适合基层实验室应用，有很好的应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为MCMVl弓丨物组的MCMV RT-LAMP检测的反应时间与浊度的关系图； 图2为MCMV2引物组的MCMV RT-LAMP检测的反应时间与浊度的关系图； 图3为MCMV3引物组的MCMV RT-LAMP检测的反应时间与浊度的关系图； 图4为MCMV2引物组的RT-LAMP特异性试验结果； 图5为MCMV2组引物的RT-LAMP灵敏度试验结果； 图 6 为 MCMV2 组引物的 RT-PCR 相对灵敏度试验，M:DL2000 ;l-7:20ng、2ng、200pg、 20pg、2pg、200fg、20fg 总 RNA ;8:水。
【具体实施方式】
[0013] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0014] 具体实施例1 玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组，LAMP的两对引物序列如下： 外侧上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 外侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 内侧上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 内侧下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
[0015] 具体实施例2 玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，该检测试剂盒包括2X反应缓冲液 (配方如下：40mM 的 ρΗ8· 8 的 Tris-HCl、20mM 的 KCl、16mM 的 MgS04、20mM 的（NH4)2 S04、0. 2% 的Tween20、I. 6 M的甜菜碱和每种2. 8mM的dNTPs)，由DNA聚合酶和AMV逆转录聚合 酶组成的聚合酶混合液(聚合酶混合液中fei DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为 8 U/μ L)，浓度20 μ mol/L的内侧上游引物溶液、浓度20 μ mol/L的内侧下游引物溶液、 浓度20 μ mol/L的外侧上游引物溶液和浓度20 μ mol/L的外侧下游引物溶液，钙黄绿素 突光染料(购自Eiken公司，商品名为Fluorescent Detection Reagent)，2X反应缓冲液、 聚合酶混合液、内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液、外侧下游引物 溶液、钙黄绿素荧光染料的体积比为12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列为 内侧上游引物 MCMV2-F3 :TACATTTCCATGGCATTCCT ; 内侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外侧上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ; 外侧下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGAITTTGAITTGG。
[0016] 具体实施例3 玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法的建立 1、实验材料 (1)样本来源本发明共收集不同来源的3份玉米褪绿斑驳病毒、1份番茄环斑病毒、1 份玉米褪绿矮缩病毒、1份燕麦花叶病毒、1份小麦线条花叶病毒和1份玉米粗缩病毒阳性 样品(表1)， 表1样品来源
【权利要求】
1. 一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测引物组，LAMP的两对引物序列如 下： 外侧上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 外侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 内侧上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 内侧下游引物 MCMV2-BIP :GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG。
2. -种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特征在于：该检测试剂盒 包括2 X反应缓冲液，由DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液，浓度均 为20 ymol/L的内侧上游引物溶液、内侧下游引物溶液、外侧上游引物溶液和外侧下游引 物溶液，I丐黄绿素突光染料(购自Eiken公司，商品名为Fluorescent Detection Reagent), 所述的2X反应缓冲液、所述的聚合酶混合液、所述的内侧上游引物溶液、所述的内侧下游 引物溶液、所述的外侧上游引物溶液、所述的外侧下游引物溶液、所述的钙黄绿素荧光染料 的体积比为12. 5 :1 :2 :2 :0. 25 :0. 25 :1，引物序列为 内侧上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 内侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 外侧上游引物 MCMV2-FIP :GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGITGCCAG ; 外侧下游引物 MCMV2-BIP :GTAITCCCCCGGACGAITCATTAGTACGAGAITITGAITTGG。
3. 根据权利要求2所述的一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，其特 征在于：所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KCl、16mM的 MgS04、20mM 的（NH4) 2 S04、0. 2% 的 Tween20、1. 6 M 的甜菜碱和每种 2. 8mM 的 dNTPs，聚合酶 混合液中DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ y L。
4. 一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法，包括以下步骤： (1) 总RNA的提取 将玉米待测样本使用RNeasy Plant Mini Kit进行植物总RNA提取； (2) RT-LAMP引物的设计和合成 从GenBank调出所有玉米褪绿斑驳病毒外壳蛋白基因序列，利用DNAMAN 6. 0. 40 软件进行比对分析，找出MCMV外壳蛋白基因序列的保守区，利用LAMP引物设计软件 PrimerExplorer V4设计特异性引物并通过引物筛选获得RT-LAMP检测的最佳引物： 外侧上游引物 MCMV2-F3 :TACAITTCCATGGCAITCCT ; 外侧下游引物 MCMV2-B3 :GTAGGATTGCTGCTCCACG ; 内侧上游引物 MCMV2-FIP ：GGCCCTCTGTTCTTCAGAGCGGTGGAGGATGTTGCCAG ； 内侧下游引物 MCMV2-BIP ：GTATTCCCCCGGACGATTCATTAGTACGAGATTTTGATTTGG ； (3) 配制RT-LAMP反应体系 浓度为20 iimol/L的内侧上游引物溶液和内侧下游引物溶液各2 iiL，浓度为20 ymol/L的外侧上游引物溶液和外侧下游引物溶液各0. 25 iiL，12. 5 iiL 2X反应缓冲液， 由DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶组成的聚合酶混合液1. 0 y L，钙黄绿素荧光染料 1.0 ML，样品总 RNA2.5 iiL，无 RNase 的水补至 25 iiL; (4) MCMV的RT-LAMP目视检测 将上述反应体系进行扩增反应，反应条件为：61°C 70 min，95°C 2 min;RT-LAMP扩增 结束后，在正常光照条件下，通过裸眼观察反应管中颜色的变化来准确判定结果，若扩增产 物呈黄绿色，则样品感染玉米褪绿斑驳病毒。
5.根据权利要求4所述的一种玉米褪绿斑驳病毒的环介导等温扩增检测方法，其特征 在于所述的反应缓冲液的配方如下：40mM的pH8. 8的Tris-HCl、20mM的KC1、16mM的MgS04、 20mM的（NH4) 2 S04、0. 2%的Tween20、1. 6 M的甜菜碱和每种2. 8mM的dNTPs，聚合酶混合液 中DNA聚合酶和AMV逆转录聚合酶的浓度均为8 U/ ii L。
【文档编号】C12N15/11GK104498617SQ201410634403
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年11月12日 优先权日:2014年11月12日
【发明者】徐颖, 郑炜, 徐亚飞, 刘永丰, 黄世杰, 邱志君 申请人:中华人民共和国北仑出入境检验检疫局