一种玉米致死性坏死病双重rt-pcr的检测方法
【专利摘要】一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，本发明包括如下步骤：1）样品RNA提取：对待测样品进行RNA提取；2）对样品的总RNA进行反转录反应；3）用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性引物同时进行双重聚合酶链式反应；特异性引物为：SCMV1F、SCMV2R、MCMV3333F和MCMV4173R；4）对PCR反应的产物进行电泳检测；5）判断样品是否携带这两种病毒。
【专利说明】—种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法。
【背景技术】
[0002]玉米(Zea mays L)是全世界总产量最高、分布最广的粮食作物之一，种植面积仅次于小麦(Triticum aestivum L)和水稻(Oryza sativa L)。我国玉米种植主要分布在北方和西南山区及其它旱谷地区，年产量居世界第二位。随着我国经济的发展，畜牧业，食品业，养殖业对玉米的需求逐年增长，致使玉米生产在国民经济中的作用日增，种植面积日趋扩大。但玉米生产面临诸多的制约因素，到目前为止，国内外已报道40多种危害玉米的病毒病。
[0003]玉米致死性坏死病(corn lethal necrosis, CLN)首先于1976年在美国堪萨斯州和内布拉斯加州的部分地区被发现，目前仅在这两个州的部分地区有报道。发病植株的叶片出现明显的黄绿相间的斑驳症状沿叶脉发展，慢慢从边缘开始出现坏死，直至整片枯死，因此命名为致死性坏死病。发病植株易矮化，果穗较小、常畸形，籽粒少，甚至不结籽，造成严重减产。玉米的任何一个生长期都对CLN敏感，早期被感染的植株常败育，后期被侵染的植株不易出现黄绿斑驳的叶部症状，主要表现为果穗结实率不高。目前多数品种对CLN没有抗性，无药剂可防治，因此一旦发生将会对生产带来毁灭性打击。
[0004]CLN是由两种病毒混合侵染引起的-玉米褪绿斑驳病毒(Maize chlorotic
mottle virus,MCMV)与甘鹿花叶病毒(Sugarcane mosaic virus, SCMV)共同侵染。当其中一种病毒单独侵染都只出现浅绿色的斑驳，且对产量影响较小。SCMV是一种世界性分布的病毒，可由蚜虫传播，在我国的玉米产区广泛发生。MCMV分布在美国、秘鲁、墨西哥和巴西，可通过西花蓟马和种子携带传播。MCMV是一种新的外来入侵危险性有害生物，除云南外国内尚未发现该病毒和危害，对它的研究几乎`为空白。
[0005]种子健康检测是控制种传性病毒病害的第一道防线，也是防止种传性病毒病害传入最有效的措施，因此检测的准确性和方便性是种子健康性检测工作的核心因素。同时，田间病害调查中在早期发现染病植株并及时根除是阻止病毒病害扩散的重要措施之一。因此一个快速有效的检测方法对病毒病害的防治极为重要。目前在病毒检测中常用的检测方法主要是血清学检测和分子生物学检测两大类。血清学检测方法操作较简单、成本低，缺点是灵敏度较低，对于种子等繁殖材料中病毒含量较低时容易出现假阴性的结果。分子生物学检测方法根据原理不同，分为PCR检测、实时荧光PCR、分子杂交等几类，其中PCR技术是使用最为广泛的一种，其成本较血清学检测方法略高，但是其灵敏度大为提高，这样对健康检测是十分必要的。玉米致死性坏死病是一种由两个病毒混合侵染引起的重要病害，目前现有报道的方法都是单独针对每一种病毒进行检测，如闻伟刚等人发表的“玉米褪绿斑驳病毒实时荧光RT-PCR检测方法研究”和李利君等人发表了 “利用斑点杂交法和RT-PCR技术检测甘蔗花叶病毒”，两个病毒的检测需要分开进行。
[0006]目前除本发明以外，无任何文献报道在一个反应管中可以同时检测玉米致死性坏死病的两种致病病毒。
【发明内容】
[0007]本发明的目的是针对玉米致死性坏死病的检测需求，提供一种可以快速、准确检测该病害的两种病原病毒的分子生物学检测方法，以简化操作、减少工作量、提高效率，填补相关方法缺失的空白，满足实际种子健康检测和病害调查的需求。[0008]本发明的一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法的建立具体包括下列步骤:
[0009]一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，本发明包括如下步骤:
[0010]I)样品RNA提取:对待测样品进彳丁 RNA提取；
[0011]2)对样品的总RNA进行反转录反应；
[0012]3)用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性引物同时进行双重聚合酶链式反应；特异性引物为:SCMV1F、SCMV2R、MCMV3333F和MCMV4173R ;引物序列分别为:SCMV1F，YGAHGCCATAAAGAAGGAGTAYG ；SCMV2R, GTGTGTCTCTCTGTATTCTCCTG ；
[0013]MCMV3333F, GGTGTACTCGATCGATCAGAC ；MCMV4173R,
[0014]AAACACTTTGGATTGGCAGGAC ；
[0015]4)对PCR反应的产物进行电泳检测，可以采用1%的琼脂糖胶进行电泳实验并拍照、分析；
[0016]5)判断样品是否携带这两种病毒。
[0017]本发明步骤2)的具体参数为:待测样品的总RNA取2_5μ1，加入引物20μΜ随机引物1μ I和20μΜ oligodT18ly I,于75°C变性5min，立即置于冰上放置5min ;随后加入 5XRT buffer 5μ l,5mM dNTP2 μ 1、40U/μ I PRI0.5 μ I 和 200U/μ I 0.5 μ 1，加入Rnase-free water或DEPC处理的水将总体积补齐至25 μ I,混匀后进行反转录反应,反应条件为30min, 42°C, 45min, 70°C, 15min,迅速放冰上冷却，合成的cDNA可立即用于下一步反应或4°C作短期保存，长期保存放置于_20°C。
[0018]本发明步骤3)的具体参数为:用引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R对cDNA进行PCR扩增；反应体系如下:
[0019]
ddH209.2 μ?
IOxPCR buffer2.0 μ?
25mM MgCl21,2 μ!
[0020]
SmM dNTP0,4 μ?
20μΜ MCMV3333F2 μ?
20μΜ MCMV4173R2 μ?
20μΜ SCMVlF0.5 μ?
20μΜ SCMV2R0.5 μ?
cDNA2.0 μ?
5 U/μL Taq0.2 μ?
总体积20 μ?[0021]反应条件为:94°C5min ；94°C 30sec,52°C 30sec,72°C 40sec，30 个循环；72°CIOmin0
[0022]本发明的步骤5)的检测标准为，对步骤4)的电泳结果进行拍照和分析:若获得与玉米褪绿斑驳病毒阳性对照一致、843bp条带则为检测到玉米褪绿斑驳病毒；若获得与甘蔗花叶病毒阳性对照一致、468bp条带则为检测到甘蔗花叶病毒；若同时获得以上两条条带则为检测到两种病毒，即检测到玉米致死性坏死病；若无目标条带则未检出。
[0023]本发明方法的优点:1、在同一反应管内、只需一次反应就能用反转录-聚合酶链式反应的方法同时检测到引起玉米致死性坏死病的两种病毒；2、该方法稳定、重现性好、易于掌握，能够在一个反应管中同时检测两种病毒的技术可以显著减少工作量，提高检测效率，对商品快速通关提供保障。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1是实施例1中运用引物MCMV3333F/4173对玉米致死性坏死病阳性样品检测的结果图；
[0025]图2是实施例1中运用引物SCMV1F/2R对玉米致死性坏死病阳性样品检测的结果图；
[0026]图3是实施例2中不同退火温度下引物MCMV3333F/4173检测玉米致死性坏死病阳性样品的结果图；
[0027]图4是实施例2中不同退火温度下引物SCMV1F/2R检测玉米致死性坏死病阳性样品的结果图；
[0028]图5是实施例3中引物MCMV3333F/4173和SCMV1F/2R不同浓度混合对玉米致死性坏死病阳性样品检测的结果图。
【具体实施方式】
[0029]实施例1
[0030]分别对引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R检测有效性进行验证。
[0031]检测样本:实验室存玉米致死性坏死病样本和健康玉米叶片，均经过DAS-ELISA检测验证。
[0032]RNA提取:分别取阳性样本叶片和健康叶片500mg用液氮研磨后，用RNA提取试剂盒(Axygen)提取总RNA。
[0033]取总RNA2-5y1，加入引物 20μΜ 随机引物 1μ I和 20μΜ oligodT18 1“1，于75°〇变性5min，立即置于冰上放置5min ;随后加入5XRT buffer5 μ l、5mM dNTP2 μ 1、40υ/μ IPRI 0.5 μ I和200U/ μ I 0.5 μ 1，加入Rnase-free water或DEPC处理的水将总体积补齐至25 μ 1，混匀后进行反转录反应，反应条件为30min，42°C，45min，70°C，15min，迅速放冰上冷却，合成的cDNA立即用于下一步反应。
[0034]用引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R分别对cDNA进行PCR扩增；反应体系如
下:
[0035]ddH2013.2 μ?
I Οχ PCRbidTer2.0 μ!
25mM MgCl21.2 μ?
5mM dNTP0.4 μ!
20μΜ I山4 引物0.5 μ?
20μΜ 反 1--丨物0.5 μ? cDNA2,0 μ?
50/μ? Taq02 μ!
总体积20 μ?
[0036]反应条件为:94°C 5min ；94 °C 30sec，52 °C 30sec，72 °C 40sec，30 个循环；72°C IOmin。
[0037]用1%的琼脂糖胶进行电泳，对电泳结果进行拍照和分析:引物MCMV3333F/4173R对阳性样品能够扩增出843bp的条带，引物SCMV1F/2R对阳性样品能够扩增出468bp的条带，健康对照均无条带(见图1和图2)。
[0038]图1图注:泳道M:D2000DNA Marker，参照物片断从上至下分别为2000、1000、750、500,250和IOObp ;泳道1:玉米致死性坏死病阳性样品；泳道2:健康玉米叶片。
[0039]图1图谱特征:玉米致死性坏死病阳性样品能够扩增得到玉米褪绿斑驳病毒843bp的目的条带。
[0040]图2图注:泳道M:D2000DNA Marker，参照物片断从上至下分别为2000、1000、750、500,250和IOObp ;泳道1:玉米致死性坏死病阳性样品；泳道2:健康玉米叶片。
[0041]图2图谱特征:玉米致死性坏死病阳性样品能够扩增得到甘蔗花叶病毒468bp的目的条带。
[0042]综合图1和图2的图谱特征即为引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R能够运用于检测玉米致死性坏死病。
[0043]实施例2
[0044]用实施例1中的反转录产物为模板，进行引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R的退火温度确定实验。
[0045]PCR反应体系如实例I所述，退火温度分别设为48.1°C、49.5°C、52.0°C、53.5°C、56.1°C和 58.1°C，反应条件为:94°C 5min ；94°C 30sec，退火 30sec，72°C 40sec，30 个循环；72°C IOmin。
[0046]用1%的琼脂糖胶进行电泳，对电泳结果进行拍照和分析:引物MCMV3333F/4173R对阳性样品能够扩增出843bp的条带，引物SCMV1F/2R对阳性样品能够扩增出468bp的条带(见图3和图4)。
[0047]图3图注:泳道M:D2000DNA Marker，参照物片断从上至下分别为2000、1000、750、
500.250和 IOObp ;泳道 1-6:退火分别为 48.1°C >49.5°C >52.0°C >53.5°C >56.1°C和 58.1°C时引物MCMV3333F/4173R的检测结果。
[0048]图3图谱特征:引物MCMV3333F/4173R在48.1°C~58.1°C之间均能扩增出目的条带，且48°C~52°C条带较清晰。
[0049]图4图注:泳道M:D2000DNA Marker，参照物片断从上至下分别为2000、1000、750、
500.250和 IOObp ;泳道 1-6:退火分别为 48.1°C >49.5°C >52.0°C >53.5°C >56.1°C和 58.1°C时引物SCMV1F/2R的检测结果。
[0050]图4图谱特征:引物CMV1F/23R在48.1°C~58.1°C之间均能扩增出目的条带，49.5°C和52.(TC扩增条带较清晰。
[0051]综合图3至图4的图谱特征即退火温度不同时物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R的扩增结果存在差异，选择相同温度下两对引物都能获得良好的扩增结果，因此将两对引物的退火温度定位52 °C。
[0052]实施例3
[0053]用实施例1中的反转录产物为模板，进行双重PCR时引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R混合比例的实验。
[0054]用MCMV3333F/4173R 各 2 μ l 和 SCMV1F/2R 各 0.5 μ 1、MCMV3333F/4173R 各 0.5 μ l和SCMV1F/2R各2 μ I两个引物混合比例对cDNA进行PCR扩增；反应体系如下:
[0055]
【权利要求】
1.一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，其特征在于，包括如下步骤: 1)样品RNA提取:对待测样品进行RNA提取； 2)对样品的总RNA进行反转录反应； 3)用甘蔗花叶病毒和玉米褪绿斑驳病毒的特异性引物同时进行双重聚合酶链式反应；特异性引物为:SCMV1F、SCMV2R、MCMV3333F和MCMV4173R ;引物序列分别为:SCMV1F，YGAHGCCATAAAGAAGGAGTAYG ；SCMV2R, GTGTGTCTCTCTGTATTCTCCTG ；
MCMV3333F, GGTGTACTCGATCGATCAGAC ；MCMV4173R,
AAACACTTTGGATTGGCAGGAC ； 4)对PCR反应的产物进行电泳检测； 5)判断样品是否携带这两种病毒。
2.根据权利要求1所述的一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，其特征在于，该方法的步骤2)的具体参数为:待测样品的总RNA取2-5 μ 1，加入引物20 μ M随机引物I μ I和20 μ M OligOdT18I μ 1，于75°C变性5min，立即置于冰上放置5min ;随后加入5XRTbuffer 5μ l、5mM dNTP2 μ 1、40υ/μ I PRI0.5 μ I 和 200U/μ 10.5 μ I,力卩入 Rnase-freewater或DEPC处理的水将总体积补齐至25 μ 1，混匀后进行反转录反应，反应条件为30min，42°C，45min, 70°C，15min,迅速放冰上冷却，合成的cDNA可立即用于下一步反应或4°C作短期保存，长期保存放置于_20°C。
3.根据权利要求1所述的一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，其特征在于，该方法的步骤3)的具体参数为:用引物MCMV3333F/4173R和SCMV1F/2R对cDNA进行PCR扩增；反应体系如下:
4.根据权利要求1所述的一种玉米致死性坏死病双重RT-PCR的检测方法，其特征在于，该方法的步骤5)的检测标准为，对步骤4)的电泳结果进行拍照和分析:若获得与玉米褪绿斑驳病毒阳性对照一致、843bp条带则为检测到玉米褪绿斑驳病毒；若获得与甘蔗花叶病毒阳性对照一致、468bp条带则为检测到甘蔗花叶病毒；若同时获得以上两条条带则为检测到两种病毒，即检测到玉米致死性坏死病；若无目标条带则未检出。
【文档编号】C12Q1/70GK103667535SQ201310682010
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】李旻, 赵明富, 丁元明, 雷屈文, 段禄华 申请人:云南出入境检验检疫局检验检疫技术中心