一种艾滋病（hiv-1）高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒的制作方法
【专利摘要】一种应用于生物医学临床诊断领域中的艾滋病（HIV-1）高精确核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒的基因扩增位点位于HIV基因组的5’LTR保守区域；试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HIV核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；HIV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HIV-内标、HIV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。该发明操作简便快速、成本低廉、检测灵敏度高，重复性好、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰问题。
【专利说明】—种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测的方法及其试剂
合
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医学临床诊断领域中的一种艾滋病(HIV-ι)高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒。
【背景技术】
[0002]人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)是导致一种慢性致死性疾病艾滋病(Acquired immune defiiency syndrome, AIDS)的病原微生物。由于艾滋病具有传染性和高致死性，因此已经成为世界范围内重点防控的主要疾病之一。自第一例艾滋病病例于1981首次报告艾滋病病例以来，到目前为止，艾滋病已造成超过两千五百万人死亡。中国自1985年首次发现艾滋病病例以来，艾滋病的流行呈快速爬升倾向。近年来，中国艾滋病的感染与发病人数也增长较快。中国艾滋病现状，据联合国驻华机构显示的数据，目前中国艾滋病病毒感染者约84万人，加上已经过世的24万人，总数应在100万人左右。根据世界卫生组织预测，目前虽然中国艾滋病病毒携带者占总人口的比例虽然很低，但感染总人数在亚洲位居第2位，在全球居第14位。鉴于中国是世界人口基数最大，人口最为密集的国家，一旦艾滋病大规模流行将成为一场公共卫生灾难。
[0003]HIV的诊断目前常用的诊断手段包括病毒学诊断和血清学诊断，HIV感染的病毒学诊断技术常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞进行艾滋病的诊断。血清学检测中，酶联免疫法是目前诊断艾滋病的一个主要手段。HIV酶联免疫试剂目前已经普遍用于临床，急诊，血液筛查等各个领域。但是，酶联免疫方法作为一种间接滞后的检测方`法，他所检测的目标是人体内产生的抗体而不是病原体本身。因此，虽然酶联免疫方法经过几代的改良和进化，在灵敏度、特异性、精确度和稳定性等方面有了巨大的提高。近年来核酸分子检测技术在检验医学和临床研究中显示出强大的优势，相比较酶联免疫诊断技术具有灵敏度高、特异性强、诊断快速等优点。血清中的HIV RNA是病毒复制和艾滋病进程的确切标志，所以血清中HIV RNA的检测，已成为诊断艾滋病的“金标准”方法。近几年来，通过荧光定量PCR方法直接检测HIV RNA已经成为一种通用艾滋病医学检测方法，大大提高了艾滋病的检测准确性，有利于疾病的早期诊断，可将“窗口期”大大的缩短。在艾滋病预防过程中，艾滋病高危人群的诊断是“防艾”的关键环节，而核酸诊断试剂在确诊艾滋病病毒携带者的过程中发挥了重要作用，目前，已经成为艾滋病确诊的金标准试剂。艾滋病核酸定量检测目前已经是通过国家认证临床PCR实验室的常规检测项目之一。在艾滋病患者确诊，用药和疗效预判，以及康复治疗过程中具有指导意义。同时，艾滋病病毒载量的精确判读，也为患者提供了准确的病情控制信息。
[0004]HIV为逆转录病毒科慢病毒亚科，HIV有十分高的遗传变异率，高度变异区在env基因内，变异率为20%-30%。gag和pol基因虽然较少变异，但是也存在一定概率变异，分别为gagl基因约5%-22%，pol基因为15%。所以，对于HIV核酸检测试剂来说，所用扩增引物的保守性和基因型覆盖能力，以及检测不同基因型样品的灵敏度是否一致，一直是评价此类诊断试剂产品性能的重要指标之一。也是困扰当今HIV诊断试剂向国际化发展的技术壁
垒之一。
[0005]近年来，相比于传统的病毒核酸提取技术，市场上涌现了一些简单方便的离心柱法病毒核酸提取技术，由于提取技术中的离心柱配套使用的高通量自动化离心设备成本过高，难于普及推广。因此，研究开发一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒是目前急待解决的新课题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒，该发明从根本上解决现有HIV-1核酸定量PCR技术存在的基因型覆盖不全、漏检率高、灵敏度低、准确性差等问题，其设计的引物和TaqMan荧光探针位于HIV基因组的5’ LTR区域，该引物和探针具有基因型覆盖范围广，检测灵敏度高，特异性强、稳定性好等优点。同时应用磁珠法进行RNA提取，方法简单，核酸纯度高，提取样本可为血清或血浆，样本量大，采用内标和防污染体系提高检测精确度，采用耐DNase和RNase假病毒作为工作标准品和质控品，提闻试剂盒的稳定性。
[0007]本发明的目的是这样实现的:一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，所述试剂盒的基因扩增位点位于HIV基因组的5’ LTR保守区域；试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HIV核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；HIV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HIV-内标、HIV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品；所述磁珠法核酸提取试剂盒中裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍 2-6.0mol/L, l-10mM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液A组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-lmol/L ;所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液B组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,氯化钾0.1-0.3mol/L,60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液C组成为含有 Triton X-1000.5-2.0ml/100ml,氯化钠 0.1-0.3mol/L，60-80% 乙醇；所述磁珠法核酸提取试剂盒中洗脱液组成为含有 10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ；所述磁珠法核酸提取试剂盒中磁珠液组成为直径为1 μ m的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml ;所述HIV核酸扩增试剂盒中RT-PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、RT-PCR缓冲液；HIV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针序列为:5’ -ATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCT-’ 3 (SEQID N0:l)，5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于内标检测的探针序列为:5’-CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’3 (SEQ ID NO: 2)，5’ 端标记为HEX荧光发生基团，3’端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增靶基因的上游引物序列为:5’ -CCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAG-’ 3 (SEQ ID NO: 3);用于扩增靶基因的下游引物序列为:5’-TCACACAACAGACGGGCACACAC-’3 (SEQ ID NO:4);用于扩增内标的上游引物序列为:5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’ 3 (SEQ ID NO:5);用于扩增内标的下游引物序列为:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID NO:6);所述HIV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol， 优选靶基因探针使用浓度为8pmol ;用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol，优选内标探针使用浓度为8pmol ;用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol，优选靶基因上下游引物使用浓度为20pmol ;用于检测内标的上下游引物使用浓度为5-20pmol，优选内标上下游引物使用浓度为8pmol ;所述HIV核酸扩增试剂盒中 RT-PCR 缓冲液组成为 50mmol/L Tris-HCl (PH8.3), 10mmol/L (NH4)2S04, 75mmol/LKC1，2.5mmol/LMgS04,0.15mmol/L dNTPs ;所述HIV核酸扩增试剂盒中酶混合液包括逆转录酶(M-MLV酶)、热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)、RNase抑制剂、T4噬菌体GP32蛋白；其中M-MLV酶用量为50-200U/人份，热启动Taq酶用量为3_8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份、RNase抑制剂用量为5-10U/人份、T4噬菌体GP32蛋白用量为1-5 μ g/人份；所述试剂盒中 HIV-内标是将序列 5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-’3(SEQ ID NO: 7)插入到pUC18T载体而构成的重组体；HIV内标质粒使用浓度为100-500COpieS/次，优选使用浓度为lOOcopies/次；所述试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆，HIV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由含有HIV RNA片段假病毒颗粒稀释而成，稀释基质为灭活阴性人源血浆；浓度分别为1.0X 107，1.0X106, 1.0 X 105，1.0 X 104，1.0 X 103，1.0 X 106IU/ml ;所述试剂盒需要进行RT-PCR反应，其扩增的最佳反应温度和时间为:55°C逆转录20min，1个循环；95°C 5min, 1个循环；最后94°C 10s，60°C 30s, 42个循环采集荧光信号；所述试剂盒检测样本类型为血清和血浆；试剂盒的检测灵敏度为100IU/ml，检测线性范围为500-1 X 109IU/ml ;所述荧光定量RT-PCR检测过程使用了 M-MLV+Taq酶的双酶一步法技术进行逆转录和扩增。
[0008]本发明的要点在于一种人类免疫缺陷病毒(HIV-1)核酸定量检测试剂盒。其基本原理是:首先采用纳米磁珠法提取血清、血浆样品中HIV RNA作为扩增模板，然后应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板实时荧光定量RT-PCR检测过程。同时扩增体系中引入了高效的内标系统，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性。其中，通过应用专业生物信息学软件，分析比较了 1000多条HIV基因组序列，设计了高保守性、特异性和高效性的TaqMan荧光探针和引物以及内标的探针和引物。所述靶基因和内标探针分别标记FAM和HEX荧光报告基团；所述实时荧光定量PCR产物在70-130个碱基对范围。同时，荧光定量RT-PCR检测过程使用了双酶一步法技术，避免了两步法的易污染，操作繁琐，灵敏度低等众多缺陷。”
[0009]本发明试剂盒采用吸附效果好、易于纯化的磁珠法提取血清、血浆样品中艾滋病病毒核酸作为模板，应用TaqMan荧光探针技术完成对该模板荧光定量PCR检测过程。同时在反应体系中添加了高效的内标，通过检测内标是否正常来监测待测样本中是否具有PCR抑制物，避免PCR假阴性的存在。”
[0010]本发明的优点在于:
[0011]1、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强。经测试表明本发明能够覆盖HIV-1的9个基因型，与国际先进的艾滋病核酸诊断试剂性能基本相当。
[0012]2、检测灵敏度高，重复性好。本发明使用自主开发的磁珠法核酸提取技术，能够从样品中获得高纯度艾滋病病毒(HIV-1)核酸，消除提取物对PCR反应的干扰，加大了检测样本量，提高了检测灵敏度和稳定性。
[0013]3、引入了高效的内标系统，解决了靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰等问题，能够高效的监控整个PCR扩增整个过程，避免出现假阴性结果。
[0014]4、引入RNA假病毒制备工艺，增加了 HIV核酸检测试剂的安全性，并能提供稳定的工作标准品和阳性质控品。同时，工作标准品和阳性质控品与样本同步参与核酸提取过程，能够很好的模拟真实病毒的提取状态。
[0015]5、本发明操作简便、快速、成本低廉，并且易于开发为自动化检测系统，以便对大量样品的进行高通量筛检。所检测的样品中包括人源或动物源的血液、精液、唾液。适合常规血液样品的检测，也适合自动化和高通量检测。该诊断试剂可以判断传染病的病情、预后和传染性，预测抗病毒治疗的效果，监测和评价抗病毒药物的疗效，提高血液和血液制品的筛选质量和应用于流行病学调查领域，为临床病原体载量的监测和治疗方案以及药物的筛选提供了重要参考。
[0016]一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测的方法及其试剂盒与现有技术相比，具有操作简便快速、成本低廉、检测灵敏度高，重复性好、引物和探针基因型覆盖率高、保守性高、特异性强、引入高效的内标系统、解决靶基因和内标同时扩增而导致的相互抑制和干扰问题等优点，将广泛的应用于生物医学临 床诊断领域中。
【专利附图】
【附图说明】
[0017]下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
[0018]图1是本发明检测中检所国家灵敏度参考品血清盘检测结果图。
[0019]图2是本发明检测中检所国家阴阳性参考品血清盘检测结果图。
[0020]图3是本发明检测国际HIV基因型血清盘的检测结果图。
[0021]图4是本发明内标检测结果图。
【具体实施方式】
[0022]以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
[0023]实施例一
[0024]HIV RNA的荧光定量PCR检测实例
[0025](1)试剂准备
[0026]a.RT-PCR反应液的配制
[0027]RT-PCR 缓冲液组成为 50mmol/L Tris-HCl (ΡΗ8.3)，10mmol/L (NH4) 2S04，75mmol/LKC1,2.5mmol/L MgS04,0.15mmol/L dNTPs。扩增靶基因的上游引物以及下游引物，使用浓度为20pmol，靶基因检测的探针使用浓度为8pmol，内标的上游引物以及下游引物使用浓度为8pmol,内标探针使用浓度为8pmol。
[0028]b.按比例(裂解结合液400 μ 1/人份+内标0.1 μ 1/人份)取相应量的裂解结合液及内标，充分混匀成裂解结合液-mix，瞬时离心后备用。
[0029]c.根据待测样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性和工作标准品1-4的量，按比例(RT-PCR反应液28.5 μ 1/人份+酶混合液1.5 μ 1/人份)，充分混匀成PCR-mix，瞬时离心后备用。酶混合液组成包括逆转录酶(M-MLV酶)120U、热启动Taq酶3U、尿嘧啶糖基化酶(UNG) 0.1U、RNase 抑制剂 5U、T4 噬菌体 GP32 蛋白 1 μ g。[0030](2)标本提取
[0031]a.取适量1.5ml离心管，分别标记阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4及待测样本，每管中加入400 μ 1裂解结合液，裂解液组成为含有十二烷基硫酸钠
0.5-2.5%,Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍 2-6.0mol/L, l-10mM EDTA (PH7.5)；
[0032]b.每管加入200μ 1待测样本或阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、工作标准品1-4 ;每管加入10 μ 1磁珠悬液(磁珠液直径为1 μ m的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为20mg/ml)，震荡混匀10秒钟后，室温静置10分钟，瞬时离心；
[0033]c.将离心管置于磁力架上吸附约2分钟，弃掉上清液，瞬时离心，吸干残液；
[0034]d.加入 600 μ 1 漂洗液 A，漂洗液 A 组成为含有 Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-lmol/L,60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
[0035]e.加入600μ 1漂洗液B，所述漂洗液Β组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇；用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
[0036]f.加入600μ 1漂洗液C，所述漂洗液C组成为含有TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L，60-80%乙醇。用移液器反复吸打10次后，瞬时离心。在磁力架上吸附2分钟，弃掉上清液，然后瞬时离心，将离心管再置于磁力架上吸附约2分钟，吸干残液；
[0037]g.加入40 μ 1洗脱液，所述洗脱液为含有10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3)，
0.01-0.05%Prolin300。震荡混匀10秒钟，然后65°C温浴2分钟；将离心管放置在磁力架上吸附2分钟，吸出上清液。
[0038](3)加样和检测
[0039]向含有RT-PCR反应液的反应管中，分别加入提取的样本、阴性对照、阳性对照、临界阳性对照、及工作标准品各20 μ 1，盖紧管盖，置于PCR仪上进行检测。扩增程序如下:
[0040]以ΑΒΙ7500为例，设置如表1:
[0041]表1PCR扩增程序
【权利要求】
1.一种艾滋病(HIV-ι)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒的基因扩增位点位于HIV基因组的5’ LTR保守区域。
2.一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:试剂盒包括磁珠法核酸提取试剂盒和HIV核酸扩增试剂盒，其中磁珠法核酸提取试剂盒包括裂解结合液、漂洗液A、漂洗液B、漂洗液C、洗脱液、磁珠液；HIV核酸扩增试剂盒包括RT-PCR反应液、酶混合液、HIV-内标、HIV定量参考品1-4、阴性质控品、临界阳性质控品、强阳性质控品。
3.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述磁珠法核酸提取试剂盒中裂解结合液组成为含有十二烷基硫酸钠0.5-2.5%，TritonX-1000.5-2.0ml/100ml，异硫氰酸胍 2-6.0mol/L, 1-lOmM/L EDTA (PH7.5);所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液A组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化锂0.5-lmol/L ；所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液B组成为含有Triton X-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钾0.1-0.3mol/L, 60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取试剂盒中漂洗液C组成为含有Tritonx-1000.5-2.0ml/100ml，氯化钠0.1-0.3mol/L, 60-80%乙醇；所述磁珠法核酸提取试剂盒中洗脱液组成为含有10mmol/L Tris.HC1 (PH8.3),0.01-0.05%Prolin300 ;所述磁珠法核酸提取试剂盒中磁珠液组成为直径为lym的氧化硅超顺纳米磁珠，浓度为10-40mg/ml。
4.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述HIV核酸扩增试剂盒中RT-PCR反应液包括用于检测靶基因和内标的探针、用于扩增靶基因和内标的上游引物以及下游引物、RT-PCR缓冲液；HIV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针序列为:5’-ATCTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGCTAGCT-’3 (SEQ ID N0:1),5’端标记为FAM荧光发生基团，3’端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于内标检测的探针序列为:5’ -CAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGC-’ 3 (SEQ ID NO: 2)，5’ 端标记为 HEX荧光发生基团，3’端标记为BHQ1荧光淬灭基团；用于扩增靶基因的上游引物序列为:5’ -CCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAG-’ 3 (SEQ ID NO: 3);用于扩增靶基因的下游引物序列为:5’ -TCACACAACAGACGGGCACACAC-’ 3 (SEQ ID NO:4);用于扩增内标的上游引物序列为:5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTG-’ 3 (SEQ ID NO:5);用于扩增内标的下游引物序列为:5’-TTCTCAGGACTCCAGTCGCTG-’3 (SEQ ID NO:6)。
5.如权利要求2或4所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述HIV核酸扩增试剂盒中用于检测靶基因的探针使用浓度为5-20pmol，优选靶基因探针使用浓度为8pmol ;用于检测内标的探针使用浓度为5-20pmol，优选内标探针使用浓度为8pmol ;用于检测靶基因的上下游引物使用浓度为10-30pmol，优选靶基因上下游引物使用浓度为20pmol ;用于检测内标的上下游引物使用浓度为5-20pmol，优选内标上下游引物使用浓度为8pmol。
6.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述HIV核酸扩增试剂盒中RT-PCR缓冲液组成为50mmol/LTris-HCl (PH8.3)，lOmmol/L (NH4) 2S04, 75mmol/LKCl, 2.5mmol/LMgS04,0.15mmol/L dNTPs。
7.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述HIV核酸扩增试剂盒中酶混合液包括逆转录酶(M-MLV酶)、热启动Taq酶、尿嘧啶糖基化酶(UNG)、RNase抑制剂、T4噬菌体GP32蛋白；其中M-MLV酶用量为50-200U/人份，热启动Taq酶用量为3-8U/人份、尿嘧啶糖基化酶的用量为0.05-0.2U/人份、RNase抑制剂用量为5-10U/人份、T4噬菌体GP32蛋白用量为1_5 μ g/人份。
8.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中 HIV-内标是将序列 5’ -TTCGATCTCCGTCGAACCTTGCACTCTGCATCCTGGACTCATGCTGACTGCAGACTCCACATCGACCCTACCCGACTGCTCTACTGCACTCCTGCGTCATCACGCGACTGGAGTCCTGAGAA-’ 3 (SEQ ID NO:7)插入到pUC18T载体而构成的重组体；HIV内标质粒使用浓度为100-500copies/次，优选使用浓度为lOOcopies/次。
9.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒中阴性质控品为灭活阴性人源血浆，HIV定量参考品1-4，临界阳性质控品和强阳性质控品均由含有HIV RNA片段假病毒颗粒稀释而成，稀释基质为灭活阴性人源血浆；浓度分别为 1.0X 107，1.0X 106，1.0X 105，1.0X 104，1.0X 103，1.0X 106IU/ml。
10.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-ι)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒需要进行RT-PCR反应，其扩增的最佳反应温度和时间为:55°C逆转录20min，1个循环；95°C 5min, 1个循环；最后94°C 10s，60°C 30s, 42个循环采集荧光信号。
11.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述试剂盒检测样本类型为血清和血浆；试剂盒的检测灵敏度为100IU/ml，检测线性范围为 500-1 X 109IU/ml。
12.如权利要求2所述的一种艾滋病(HIV-1)高精确核酸定量检测试剂盒，其特征在于:所述荧光定量RT-PCR检测 过程使用了 M-MLV+Taq酶的双酶一步法技术进行逆转录和扩士豳>曰ο
【文档编号】C12Q1/70GK103667534SQ201310681720
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】李望丰, 蔡一荣, 关尔鑫, 赵世源, 王丹, 肖樊, 周凯, 任旭 申请人:东北制药集团辽宁生物医药有限公司