油茶ssr分子标记的制作方法
【专利摘要】一种油茶SSR分子标记，包括油茶DNA序列的获得及预处理、DNA序列中SSR位点的检索、SSR引物的设计与合成、SSR标记体系的建立、多态性SSR标记的筛选。检索利用454测序得到油茶基因组序列及EST序列中含有简单序列重复单元的、符合条件的序列，筛选得到12个多态性丰富的SSR标记CO_gSSR11、CO_gSSR12、CO_gSSR14、CO_gSSR16、CO_gSSR19、CO_gSSR20、CO_eSSR01、CO_eSSR04、CO_eSSR16、CO_eSSR40、CO_eSSR44、CO_eSSR48。本发明适用于油茶种质资源的遗传评价、种质鉴定及分子标记辅助育种研究，重复性好、可靠性高，是一种非常有效的分子标记。
【专利说明】油茶SSR分子标记
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种DNA分子标记技术，具体涉及为油茶微卫星遗传标记的开发技术，适用于油茶的遗传多样性研究，种质鉴定和亲缘关系分析。
【背景技术】
[0002]微卫星(MiciX)Satel I He )是指广泛散布于基因组中的以少数几个核苷酸(多数为2-4个)为单位的多次串联重复的DNA序列，人们称之为简单重复序列(Simple sequencer印eats，SSR)，是基因组中变异率相对较高一类DNA序列。近些年来，SSR已经成为最流行的遗传标记。作为检测效率较高的共显性标记，SSR标记集中了其它分子标记的优点，如典型的共显性和多等位基因，具备高的多态性，能准确区分亲缘关系非常相近的个体；DNA的用量少，扩增结果的重现性高，可以有效地实现简单，快速的PCR操作，同时基因型可通过琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，也可通过引物的荧光标记进行自动分析。但是，SSR标记的开发依赖于拥有大量的DNA序列基础，而在以往，传统的微卫星开发途径主要通过构建基因组文库，费时耗力并且效率不高，局限了微卫星的运用。随着植物基因组学及生物信息学的发展，大规模基因测序技术日新月异，第二代以454测序为标志的测序技术更是推动了高通量基因组测序时代的来临。利用微卫星搜索工具从基因测序得到的大量DNA序列中查找微卫星，已然成为开发微卫星标记最为便捷、有效的方式。目前已在如松柏类树种、杨柳科树种、桉树、壳斗科树种及大部分蔷薇科树种等许多林木中开发并应用微卫星标记，并广泛的运用于指纹分析、构建遗传连锁图谱、群体遗传结构和进化分析研究。
[0003]油茶(Camellia oleifera)称之为东方的橄榄树而闻名于世，与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种。油茶主产品茶油是优质高级食用油，其成分以油酸和亚油酸为主的不饱和脂肪酸含量在90%以上，易于人体吸收，耐贮藏，不易酸败，且色美味香，深受人民的喜爱。目前油茶优树在全国范围内集中决选，各主产区间存在相互引种栽培的普遍现象，这就导致油茶各无性系的自然地域性特征不强，油茶良种、无性系及地方农家品种等相互混杂在所难免，采用有效的分子标记在遗传学角度开展油茶品种真实性的分子甄别在生产应用中变的尤为迫切；而为了研究油茶遗传变异规律，同时从大量的油茶遗传资源中选育并丰富油茶良种，开展油茶分子标记辅助育种也是其行之有效的方法。当前油茶育种工作者广泛采用的分子标记为现有的通用型分子标记，如RAPD、ISSR等均为显性标记，存在重复性差的严重缺陷，及共迁移的缺点。与其它分子标记相比，SSR标记数量丰富，基因组覆盖度 高，呈现多基因特点，信息含量高，表现为共显性遗传，重复性好，且SSR分析对DNA数量及纯度要求不高。然而迄今，油茶微卫星分子标记的开发利用研究甚少，国内只有少量利用茶树微卫星标记引物随机扩增油茶基因组的报道(刘冰等，油茶SSR-PCR反应体系建立与优化.安徽农业大学学报，2011，38(6):858-862)，此外除温强等(Wen Q etal.Development of polymorphic microsatellite markers in Camellia chekiangoleosa (Theaceae)，American Journal of Botany，2012，5 (I): e203_e205.)利用油荼类物种浙江红花油荼的EST序列开发了 18对浙江红花油荼的SSR标记外，未见利用油荼DNA序列开发油茶SSR标记的报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有技术尚未利用油茶DNA序列开发油茶微卫星标记的现状，利用454测序技术获得普通油茶基因组序列与EST序列，应用生物信息学方法，开发出油茶微卫星分子标记，建立油茶微卫星的技术体系，并应用于油茶优良高产无性系的遗传多样性研究及DNA指纹图谱构建。
[0005]为了实现上述目的，本发明的技术方案为:
[0006]( I)所述油茶SSR分子标记特征包括:微卫星分子标记编号、微卫星分子标记所对应的核苷酸序列、微卫星分子标记所对应的12个位点的引物序列；
[0007]所述的微卫星标记编号为:C0_gSSRll、C0_gSSR12、C0_gSSR14、C0_gSSR16、C0_gSSR19、C0_gSSR20、C0_eSSR01、C0_eSSR04、C0_eSSR16、C0_eSSR40、C0_eSSR44、C0_eSSR48 ；
[0008]所述微卫星分子标记所对应的核苷酸序列分别为:
[0009]
【权利要求】
1.一种油荼SSR分子标记，其特征包括:微卫星分子标记编号、微卫星分子标记所对应的核苷酸序列、微卫星分子标记所对应的12个位点的引物序列； 所述的微卫星标记编号为:C0—gSSRll、CO—gSSR12、C0—gSSR14、C0—gSSR16、C0—gSSR19、CO—gSSR20、CO—eSSROl、CO—eSSR04、CO—eSSR16、CO—eSSR40、CO—eSSR44、CO—eSSR48 ； 所述微卫星分子标记所对应的核苷酸序列分别为:
2.根据权利要求1所述油茶SSR标记体系特征包括:PCR反应体系和PCR反应程序。PCR反应体系:10μ I中含IOXPCR缓冲液I μ 1，Mg2 + 2.5mM, dNTPs200 μ M，上下游引物各0.2 μ M，Taq聚合酶1U，DNA30ng左右； PCR 反应程序:94°C预变性 5min ；94°C, 30s, Ta, 30s, 72°C, 30s, 30 个循环；最后 72。。延伸lmin，8度保存。各引物对应的退火温度Ta详见下表:
【文档编号】C12Q1/68GK103667275SQ201310681868
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】温强, 刘丽婷, 徐立安, 徐林初, 周文才, 叶金山, 朱恒, 黄敏仁 申请人:江西省林业科学院