茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR 内参基因及其筛选方法和应用。
【背景技术】
[0002] 茶树（Camelliasinensis)原产于我国热带及亚热带，是一种喜温畏寒的多年生 经济作物。随着茶产业的不断发展，茶树种植区域向北扩展到北炜38°，我国大部分茶区， 特别是高山茶园，常遭遇到越冬期低温冻害或春季"倒春寒"。寒冻害已成为我国茶叶优质 高产栽培生产中一个较为突出、亟待解决的问题。长期以来，茶园抗寒一般都是采用优化栽 培措施、改善栽培条件来提高茶树的耐寒性，但是品种的抗寒遗传特性才是起决定作用的 因素。因此，研究茶树对寒冻害的抗逆机制，解析其响应低温的基因表达调控网络，有针对 性地发掘相关抗性基因并加以利用，对开展茶树分子育种工作有着积极意义。
[0003] 基因表达分析在生物学研究中已成为一个揭示基因水平和生长机制的重要方法。 实时焚光定量PCR(thereal-timefluorescencequantitativePCR，qRT_PCR)与传统PCR 相比，由于具有重复性好，特异性强和灵敏度高及高通量等特点，已经成为一种快速且可靠 的基因转录水平的定量方法。然而，有效的qRT-PCR却取决于很多因素，如提取的RNA的质 量、反转录的效率、引物特异性以及数据处理方法等，而采用稳定表达的内参基因来控制实 验误差也是必要的。
[0004] 在qRT-PCR中，最常用的植物内参基因有甘油醛三磷酸脱氢酶 (glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白基因（0 -actin，ACT)、 翻译延伸因子（translationelongationfactor,TEF)、0-微管蛋白（0-tubulin,TUB)、 18S核糖体RNA基因（18SribosomalRNAprotein, 18SrRNA)以及 25S核糖体RNA基因 (25SribosomalRNAprotein, 25SrRNA)等。在用qRT-PCR分析基因的相对表达时，研究 者们发现不经筛选直接使用常见内参基因，会降低实验结果的准确性。如U6是研究miRNA 相对表达量最常用的一个内参基因，已有报道表明U6在人正常和癌变组织中的表达是不 稳定的，其结果所导致的差异近62倍，不可作为该研究的内参基因。Szabo等人认为在所有 样本中都无差异表达的内参基因是不存在的，作为常用内参基因的持家基因的表达也不是 一直稳定不变的。为了找到适合的内参基因，一般实验前要对多个候选内参基因的稳定性 进行评估。在紫花苜蓿不同组织中，5个候选内参基因（18SrRNA、f3-actin、EF-la、UBC2、 TUB)中属18SrRNA和EF-1a的表达最稳定；在苹果着色不同时间点的果皮中，4个常用候 选持家基因（0 -actin、EF-1a、GAPDH、18SrRNA)中属EF-1a和18SrRNA是比较理想的 内参基因；多年生黑麦草在非生物胁迫下，6个候选内参基因（eIF4A、TBP-l、E2、UBQ、ZTL、 GAPDH)中，eIF4A和UBQ可作为不同胁迫下的内参基因；在茶树的94个不同样品中检测 11个候选内参基因的稳定性发现，3个常被使用的持家基因（CsTUBULINl，CsACINTl、Csl8S rRNAl)是最不稳定的，而CsPTBl,CsEFl,CsSANDl,CsCLATHRINl和CsUBCl的稳定性却位列 前五。
[0005]microRNAOniRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码小片段RNA，在基因的 转录后调控上起到重要作用，对其表达水平的定量研究已成为一种常见实验，选择合适的 内参基因是确保实时荧光定量PCR(qRT-PCR)准确性的先决条件。与具有编码功能的基因 的定量分析有所不同，常用于miRNA荧光定量的内参基因多为一些片段长度相对较短的 基因，如U6(smallnuclearRNA)、5.8S核糖体rRNA(5. 8SribosomalRNAprotein，5.8S rRNA)、5S核糖体rRNA(5SribosomalRNAprotein，5SrRNA)等，像GAPDH、18SrRNA等也 有使用。关于常用内参基因稳定性的争议一直不断，不少实验证实这些常用内参基因在不 同物种、组织以及试验处理下，其表达并不是恒定不变的。
[0006] 为了探讨miRNA在茶树低温胁迫下的调控机制，筛选出低温胁迫下稳定表达的茶 树miRNAqRT-PCR内参基因，这也是开展miRNA差异表达的定量分析前需要解决的关键问 题之一。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的是提供一种茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR内参基因及其筛选 方法和应用。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。
[0009] 一方面，本发明提供一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因PC-222-3P，其具有如 SEQIDNO: 1所示的核苷酸序列。
[0010] 另一方面，本发明提供一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因PC-222-3P的前体， 其具有如SEQIDN0:2所示的核苷酸序列，该前体可在茶树细胞内被剪切且表达成miRNA Pc_222_3p〇
[0011] 再一方面，本发明还提供上述茶树miRNA荧光定量PCR内参基因PC-222-3P的筛 选方法，所述筛选方法包括如下步骤：
[0012] 1)选择内参候选基因及引物设计：
[0013]选择 6 个植物miRNA内参基因U6、18SrRNA、26SrRNA、5. 8SrRNA、5SrRNA和 GAPDH，另外选择3个茶树miRNAcs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p作为内参候选基 因，其中，cs-miR396的核苷酸序列如SEQIDN0:3所示，Pc-45545-5p的核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示，并设计荧光定量PCR引物；
[0014] 2)内参候选基因的荧光定量PCR实验：
[0015] 提取不同温度处理下的茶树成熟叶片和4°C下茶树不同器官样品的RNA，反转录 生成第一链miRNAcDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤1)中设计的引物为荧光定量PCR 引物，进行荧光定量PCR实验，获得荧光定量PCR数据；
[0016] 3)内参候选基因的稳定性分析：
[0017] 利用BestKeeper和geNorm软件对步骤2)中获得的焚光定量PCR数据进行表达 稳定性分析，筛选出稳定表达的内参基因；
[0018] 其中，用BestKeeper进行Ct值的标准偏差（SD)和变异系数（CV)分析，Ct值的 标准偏差（SD)和变异系数（CV)越小，基因表达稳定性越高；用geNorm对基因表达稳定度 的平均值M进行分析，以基因表达稳定度的平均值M作为评估内参表达稳定性的阈值，M值 越低，基因表达稳定性越高。
[0019] 优选地，所述步骤1)中，所述内参候选基因的荧光定量PCR引物为：
[0020] 1]6的正向引物1]6?如5￡〇10勵:5所示，反向引物1]61?如5￡〇10勵:6所示；
[0021] 18SrRNA的正向引物18SrRNAF如SEQIDN0:7所示，反向引物18SrRNAR如 SEQIDN0:8 所示；
[0022] 26SrRNA的正向引物26SrRNAF如SEQIDNO:9所示，反向引物26SrRNAR如 SEQIDN0:10 所示；
[0023] 5. 8SrRNA的正向引物 5. 8SrRNAF如SEQIDNO: 11 所示，反向引物 5. 8SrRNA R如SEQIDNO: 12 所示；
[0024] 5SrRNA的正向引物 5SrRNAF如SEQIDNO: 13所示，反向引物 5SrRNAR如SEQ IDNO: 14 所示；
[0025] 6六?011的正向引物6六?011?如5￡〇10勵：15所示，反向引物6六?0111?如5￡〇10 NO: 16所示；
[0026]cs-miR396b的正向引物cs-miR396bF如SEQIDN0:17 所示，反向引物 cs-miR396bR由miRNA荧光定量PCR试剂盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBR Green))提供；
[0027]Pc-222-3p的正向引物Pc-222-3pF如SEQID勵：18所示，反向引物卩(：-222-3口 R由miRNA焚光定量PCR试剂盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBRGreen))提 供；
[0028]Pc-45545-5p的正向引物Pc-45545-5pF如SEQIDNO: 19 所示，反向引物 Pc-45545-5pR由miRNA荧光定量PCR试剂盒（miRcutemiRNAqPCRDetectionKit(SYBR Green))提供。具体序列参见表l〇
[0029] 优选地，所述步骤2)中，所述不同温度处理指在25°C、4°C、0°C和_4°C下处理8小 时；所述不同器官包括成熟叶、芽、嫩茎、种子、根。
[0030] 优选地，所述步骤2)中，所述荧光定量PCR实验的程序为：94°C预变性2min，94°C 变性20s，60°C退火延伸34s，40个循环，，然后进行60~95°C溶解曲线分析，溶解曲线数据 由实时荧光定量PCR仪自动读取。
[0031] 表1qRT-PCR中候选内参基因的引物序列及扩增长度
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