DH；H:cs-miR396b； I:Pc-45545-5p，9个候选基因的平均Ct值为17-30,其中18SrRNA和5SrRNA的Ct值都在 18左右，表明它们在样本中的起始拷贝数很高，表达丰度高。9个候选内参基因的熔解曲线 均呈显著的单一峰，说明引物能特异地扩增目的片段，且每个样品的扩增曲线重复性较好， 表明qRT-PCR结果较准确。
[0067] 内参候选基因的稳定性分析
[0068] 用BestKeeper(http://www.gene-guantification.de/bestkeeper.html)和 ReNorm(http://medgen.ugnt.be/^ivdesomp/Renorm/)软件分析获得的焚光定量PCR数 据，以进行9个候选内参基因在不同温度以及不同组织中的表达稳定性进行分析，筛选出 稳定表达的内参基因。
[0069] 将9个候选内参基因的Ct值直接输入BestKeeper软件中计算Ct值的标准偏差 (SD)和变异系数（CV)，通过比较Ct值的标准偏差（SD)和变异系数（CV)来判断各内参基 因的稳定性，ct值的标准偏差（SD)和变异系数（CV)越小，候选内参基因的表达稳定性越 高。结果如表2和表3所示，不同温度处理下和茶树不同组织中Pc-222-3p的Ct值的标准 偏差（SD)和变异系数（CV)均最小，因此其表达最稳定，其次是18SrRNA、26SrRNA。而U6、 5. 8SrRNA、GAPDH等基因SD值或CV值较大，表达并不稳定。
[0070] 利用geNorm软件进一步评估9个候选内参基因在不同温度和不同组织器官中的 表达稳定性。geNorm软件分析时需要将Ct值转换成相对表达量Q，Q=EACt，E为基因扩 增效率，ACt=Ctmin-Ct(Ctmin:样品中最低值；Ct:每个样品的值）。geNorm软件通过 计算基因表达稳定度的平均值（M)来对基因表达稳定度进行排序。M值是由单个内参基因 与其他所有选择内参基因Q值两两相除取1〇&值，然后计算其标准偏差，最后取n-1个标 准偏差的算术平均数作为M值。M值越低，基因表达稳定性越好，geNorm软件默认将M= 1.5作为评估内参表达稳定性的阈值。结果如图4所示，在不同温度处理下，只有26SrRNA M值高于1. 5,其他（8个）候选基因表达都较稳定（M〈l. 50)，其中Pc-222-3p和18SrRNA 的M值最小（M= 0.076)(图4a);在茶树不同组织中有5个基因表达稳定（M〈 1.50)，其中 Pc-222-3p和5. 8SrRNA的M值最小（M= 0. 761)，而常用的内参U6的M值为1. 62,并不 稳定（图4b)。综合BestKeeper和geNorm软件分析结果，表明茶树miRNAPc-222_3p在 不同温度处理下和不同组织器官中荧光定量PCR实验的Ct值的标准偏差（SD)和变异系数 (CV)均最小，基因表达稳定度的平均值M最低，因此，茶树miRNAPc-222-3p基因表达稳定 性高，可以作为茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR的内参基因。
[0071] 表2不同温度处理下9个茶树候选内参基因稳定性的BestKeeper分析
[0072]
[0073] 表3茶树不同组织器官中9个候选内参基因稳定性的BestKe印er分析
[0074]
[0075]miRNAPc-222-3p序列为UUUCCAAGACCACCCAUGCCGA(SEQIDNO:1)，不能比对到 miRBase(20.0)中现有miRNA的成熟体及前体序列，但可以比对到茶树基因组上。延伸其 在茶树基因组中序列，获得其前体序列为aaaaaauuacauguagacagagagaggaauaagagggaaagg gaggcagaucugcacgaaguuauuggcauggugaucuugggaaagaaagaguuguguuuuagaucuUUUCCAAGACC ACCCAUGCCGAugauuucuugcggauccucccuuucccuaacuuguccuauuuagaucuaaucuuaauuuaug(SEQ IDN0:2)，该前体可在茶树细胞内被剪切且表达成miRNAPc-222-3p。
[0076] 以上对本发明【具体实施方式】的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本 发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范 围。
【主权项】
1. 一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p，其具有如SEQ ID NO: 1所示的 核苷酸序列。2. -种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的前体， 其具有如SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列。3. -种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p的筛选方 法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤： 1) 选择内参候选基因及引物设计： 选择 6 个植物 miRNA 内参基因 U6、18S rRNA、26S rRNA、5. 8S rRNA、5S rRNA 和 GAPDH， 另外选择3个茶树miRNA cs-miR396b、Pc-222-3p和Pc-45545-5p作为内参候选基因，其中， cs-miR396的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示，Pc-45545-5p的核苷酸序列如SEQ ID N0:4 所示，并设计荧光定量PCR引物； 2) 内参候选基因的荧光定量PCR实验： 提取不同温度处理下的茶树成熟叶片和4°C下茶树不同器官样品的RNA，反转录生成 第一链miRNA cDNA，作为荧光定量PCR的模板，以步骤1)中设计的引物为荧光定量PCR引 物，进行荧光定量PCR实验，获得荧光定量PCR数据； 3) 内参候选基因的稳定性分析： 利用BestKeeper和geNorm软件对步骤2)中获得的焚光定量PCR数据进行表达稳定 性分析，筛选出稳定表达的内参基因； 其中，用BestKeeper进行Ct值的标准偏差（SD)和变异系数（CV)分析，Ct值的标准 偏差（SD)和变异系数（CV)越小，基因表达稳定性越高；用geNorm对基因表达稳定度的平 均值M进行分析，以基因表达稳定度的平均值M作为评估内参表达稳定性的阈值，M值越低， 基因表达稳定性越尚。4. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述内参候选基因的 荧光定量PCR引物为： U6的正向引物U6F如SEQ ID NO: 5所示，反向引物U6R如SEQ ID NO:6所示； 18S rRNA的正向引物18S rRNA F如SEQ ID NO: 7所示，反向引物18S rRNA R如SEQ ID NO:8 所示； 26S rRNA的正向引物26S rRNA F如SEQ ID NO:9所示，反向引物26S rRNA R如SEQ ID NO: 10 所示； 5. 8S rRNA的正向引物5. 8S rRNA F如SEQ ID NO: 11所示，反向引物5. 8S rRNA R如 SEQ ID NO: 12 所示； 5S rRNA的正向引物5S rRNA F如SEQ ID NO: 13所示，反向引物5S rRNA R如SEQ ID NO: 14所示； GAPDH的正向引物GAPDH F如SEQ ID NO: 15所示，反向引物GAPDH R如SEQ ID NO: 16 所示； 〇81111?39613的正向引物〇81111?396匕？如5￡0 10勵：17所示，反向引物〇81111?396匕1?由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供； ?(3-222-3口的正向引物？(3-222-3口？如5￡0 1〇勵：18所示，反向引物？(：-222-3口1?由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供； Pc-45545-5p 的正向引物Pc-45545-5p F如SEQ ID N0:19所示，反向引物Pc-45545-5p R由miRNA荧光定量PCR试剂盒提供。5. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述不同温度处理指 在25°C、4°C、0°C和-4°C下处理8小时；所述不同器官包括成熟叶、芽、嫩茎、种子、根。6. 根据权利要求3所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤2)中，所述荧光定量PCR实 验的程序为：94°C预变性2min，94°C变性20s，60 °C退火延伸34s，40个循环，然后进行60~ 95°C溶解曲线分析，溶解曲线数据由实时荧光定量PCR仪自动读取。7. -种根据权利要求1所述的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p作为茶树 低温胁迫下miRNA的qRT-PCR内参基因的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p，其具有如SEQ？ID？NO:1所示的核苷酸序列，及其筛选方法，该方法挑选了6个常见植物miRNA内参基因，和3个茶树miRNA作为候选内参基因，利用qRT-PCR技术，通过BestKeeper和geNorm两个软件来评估候选内参基因在不同低温胁迫下及不同茶树组织中的表达稳定性，以期为茶树低温胁迫下miRNA差异表达分析的内参基因选择提供参考。获得的茶树miRNA荧光定量PCR内参基因Pc-222-3p在不同温度处理下和在茶树不同组织中，其基因表达均稳定，可以作为茶树低温胁迫下miRNA荧光定量PCR的内参基因。
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132417
【申请号】CN201510564178
【发明人】李叶云, 班秋艳, 添先凤, 谢小芳, 江昌俊
【申请人】安徽农业大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年9月7日