一种cyp2c9*3基因扩增的检测引物组及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种SNP的试剂盒，具体讲，涉及一种CYP2C9*3基因扩增的检测引物 组及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 华法林是临床常用治疗血栓性疾病的一种香豆素类口服抗凝药，具有抗凝和溶 栓的双重作用。华法林的抗凝治疗指数范围狭窄，如果剂量不足则达不到治疗效果，剂量 稍过量则会引起出血，重者危及病人生命。然而，华法林血浆药物浓度和疗效存在明显的 个体差异和种族差异，有研究表明，不同患者使用抗凝血药物华法林的剂量可以相差20 倍，亚洲人的维持剂量比白种人要低30%~40%。因此，如何在临床上安全、合理使用华 法林长期以来是许多研究者关注的重点和难点。
[0003] 近年来，随着药物基因组学的发展和华法林药理作用分子机制的阐明，单核苷 酸基因多态性在华法林用量个体差异中的作用越来越受到人们的重视。目前，已知与华 法林的药效学和药动学相关的基因达30余种，其中细胞色素P4502C9基因（Cytochrome P4502C9，CYP2C9)的基因多态性是影响华法林用量个体差异最主要的遗传因素之一。细 胞色素氧化酶P450可直接将华法林代谢为无活性的产物，而华法林是维生素K的拮抗剂 (VKA)，通过抑制肝脏环氧化还原酶而产生抗凝作用。因此，CYP2C9基因决定了华法林的抗 凝效果。
[0004] CYP2C9即是华法林最主要的代谢酶。到目前为止，已发现的CYP2C9的等位基因 有30种，其中以*1(野生型）、*3(11 63591^11，3即^1057910)最为常见。携带有变异性 等位基因的患者，其华法林代谢酶的活性明显低于野生型，并且其出血的危险性增加2~ 3倍。
[0005] 华法林有R和S两个亚型，其中S型抗维生素K的作用最明显，R型在体内基本不 起作用。细胞色素氧化酶P450CYP2C9基因可将S型华法林代谢为无活性或低活性的产物， S型华法林直接作用于维生素K环氧化物还原酶，使维生素K的氧化型和还原型不能相互 转化，从而抑制维生素K的功能，同时也抑制一些凝血因子的激活。大量研究证明，CYP2C9 基因多态性可影响华法林的起始使用剂量，CYPC9*3AA型用药剂量最高，AC杂合型次之，CC 型最低。华法林在不同种族、年龄、性别人群中的剂量千差万别，很大的原因在于CYP2C9基 因的多态性。而CYP2C9基因中，通过检测位点的多态性然后再结合患者相关临床信息运用 药理遗传学的相关法则基本上可确定华法林的起始使用剂量。
[0006] 美国FDA批准的基因诊断和检测项目有2000项左右，其中1290多项已完全批准 用于临床，大约1000项正在审批过程中。实践证明，基因多态性检测是有效的。我国应该 使用华法林而未使用的人群达90%左右，房颤患者仅有6. 6%正确使用华法林，其原因是 不能确定华法林使用的准确剂量，不能规范监测INR。这样，房颤导致卒中患者明显增加，临 床统计显示大约有1/3的脑卒中患者由房颤引起。倘若临床医生通过基因检测的手段来确 定华法林的起始使用剂量，安全使用华法林，就会减少房颤的致残率和致死率。
[0007] 以下是现在对CYP2C9*3的分型方法。
[0008] Taqman方法：针对SNP位点变异设计特异性的探针，探针标记成本较高；采用荧光 淬灭及双末端标记技术，有淬灭难以彻底、本底较高的缺陷；采用酶外切活性，定量时受酶 性能的影响。
[0009] DHPLC技术和质谱分析：分别需要用到高效液相色谱仪与质谱仪，设备昂贵，难以 在临床诊测中推广。
[0010] DNA芯片：由于高通量等优点在SNP检测中得到大量应用，但其依靠野生型与突 变型基因杂交动力学的差异对突变位点进行检测，由于不同位点之间的杂交动力学差异不 同，在进行多位点同时检测时条件难以控制、可重复性差，易出现假阳性假阴性结果。
[0011] 微测序：作为一种基于阵列的突变分析，目前还面临着如何降低假阴性率和靶核 苷酸序列组成的变异等关键问题。
[0012] 高温连接酶法：高温连接酶检测反应（ligase detection reaction，LDR)是近几 年逐渐引起人们注意的一种新型基因多态性检测方法，该技术操作简单、稳定，结果可靠。 俗称小测序。
[0013] 限制性酶切方法（RFLP):准确性较好，费用也较低.但只能对一部分含有现成酶 切位点的多态位点进行分型。
[0014] SNaPshot法：基于焚光标记单碱基延伸原理的分型技术，通常用于10-30个SNP 位点分析。
[0015] DNA测序法：相对准确，价格较贵。DNA链的二级结构容易造成人工假相，使测序 结果出现偏差。
[0016] 高分辨率熔解曲线法（HRM):是近几年兴起的SNP研究工具该方法，无需设计探 针，成本低，但结果准确度较低。
[0017] 扩增阻碍突变系统（Amplification refractory mutation system，ARMS)):本技 术通过涉及特异性的引物，有选择性的扩增野生或突变模版，通过扩增产物的量来确定是 否为野生型或突变型，利用PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增 的原理，设计等位基因特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物3'碱基与模板配 对时才能出现PCR扩增带，从而检测出突变。在不同的引物上加上3个T对扩增出的片段 进行区分。
[0018] 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE)又称高效毛细管电泳（high performance capillary electrophoresis，HPCE)，是一类以毛细管为分离通道、以高压直 流电场为驱动力的新型液相分离技术。毛细管电泳实际上包含电泳、色谱及其交叉内容，它 使分析化学得以从微升水平进入纳升水平，并使单细胞分析，乃至单分子分析成为可能。 [0019]目前国内对CYP2C9*3的研究尚属空白，更没有成熟的检测方法或试剂。
[0020] 有鉴于此，特提出本发明。
【发明内容】
[0021] 本发明提供一种CYP2C9*3基因扩增的检测引物组；
[0022] 本发明提供一种CYP2C9*3基因扩增的检测试剂盒。
[0023] 为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：CYP2C9*3基因扩增的 检测引物组，所述CYP2C9*3检测引物组包括：
[0024] CYP2C9*3-PD-F1 :如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:1所示的核 苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0025] 0￥?209*3-?042:如5￡〇10勵:2所示的核苷酸序列，或由5￡〇10勵:2所示的核 苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0026] CYP2C9*3-PD-R :如SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，或由SEQ ID N0:3所示的核 苷酸序列经取代、缺失、添加形成的核苷酸序列；
[0027] 所述CYP2C9*3-PD_R为荧光引物，其5'端标记有荧光基团；
[0028] 作为本发明的优选技术方案，所述荧光基团选自由6-羧基荧光素、六氯-6-甲基 荧光素、VC荧光染料、四氯-6-羧基荧光素、羧基-X-罗丹明、6-羧基四甲基罗丹明、磺酰罗 丹明、6-羧基-4'，5' -二氯-2'，7' -二甲氧基荧光素琥珀酰亚胺酯、花菁3、花菁5或花 菁5. 5中的至少一种。
[0029] 作为本发明的优选技术方案，所述CYP2C9*3-PD_R的荧光基团为6-羧基荧光素。
[0030] CYP2C9*3基因扩增检测试剂盒，包括以上所述的CYP2C9*3基因扩增的检测引物 组。
[0031] 作为本发明的优选技术方案，还包括含Mg2+、Taq酶及dNTPs的PCR反应液。
[0032] 作为本发明的优选技术方案，还包括阴性质控品、阳性质控品；
[0033] 所述阴性质控品为纯化水；所述阳性质控品为灭活全血。
[0034] 作为本发明的优选技术方案，所述试剂盒分为阴性质控品、阳性质控品、CYP2C9*3 反应体系；
[0035] 所述CYP2C9*3反应体系包括CYP2C9*3PCR反应液12. 5 y L，CYP2C9*3引物混合液 6. 5 y L，待测样本DNA2 y L，纯化水4 y L，共配成25 y L反应体系；
[0036] 其中所述CYP2C9*3引物混合液的组成为：1. 5 y L的CYP2C9*3-PD-F1，1. 5 y L的 CYP2C9*3-PD-F2,1. 5 y L 的 CYP2C9*3-PD-R。
[0037] CYP2C9*3阳性质控品的构建方法包括以下步骤：
[0038] (1)用无菌注射器在受检者手臂弯曲处或手背处抽取静脉血3~5mL，置于EDTA 抗凝管（紫盖）内，轻轻颠倒混匀；
[0039] (2)用天根全血试剂盒进行基因组提取；
[0040] (3)提纯的基因利用紫外分析法测定吸光度，计算浓度，最佳浓度为50ng/ml。
[0041] CYP2C9*3基因扩增检测试剂盒的使用方法，具体过程如下：
[0042] (1)样本处理和核酸提取；
[0043] (2)进行PCR反应；
[0044] (3)通过基因分析仪检测，得到片段分析结果。
[0045] 所述的待测样本的处理方法包括：磁珠提取法、柱提法、煮沸裂解法和十六烷基三 甲基溴化铵法，优选柱提法。
[0046] 作为本发明的优选技术方案，步骤（1)中所述的样本为人类基因组DNA，0D260/ 0D280 在 1. 8-2. 0, DNA 总量在 3-15yg,稀释 DNA 的终浓度至 50-125ng/yL。
[0047] 作为本发明的优选技术方案，稀释DNA的终浓度至50ng/yL。
[0048]作为本发明的优选技术方案，步骤（2)中PCR反应的反应条件为：37°C保温2分钟 后；95°C预变性3分钟，92~95°C，10~15秒，55~65°C，10~35秒，共35~45个循环； 优选为：37°C保温2分钟后；95°C预变性3分钟；94°C，15秒；60°C，35秒；7