同时检测番茄黄化曲叶病毒及伴随的越南番茄黄化曲叶卫星DNAβ的方法及其专用引物组的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种同时检测番茄黄化曲叶病毒及伴随的越 南番茄黄化曲叶卫星DNA0的方法及其专用引物组。
【背景技术】
[0002] 双生病毒（Geminivirus)是一类具有孪生颗粒形态的单链环状植物DNA病毒， 在世界范围内广泛发生，并已在多种作物上造成毁灭性危害。自20世纪90年代起，在中 国的云南、广西、广东和福建等南方各省（区）该病毒病害危害日趋严重。番茄黄化曲叶 病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV)和中国番木瓜曲叶病毒（Papayaleaf curlChinavirus，PaLCuCNV)都属于双生病毒科（Geminiviridae)菜豆金色花叶病毒属 (Begomovirus)成员，番前黄化曲叶病毒于20世纪50年代末始发于以色列，目前已在全世 界40多个国家和地区大面积暴发，自20世纪90年代传入我国以来，由南向北、自东向西迅 速全国性蔓延，已在台湾、广东、广西、浙江、江苏、上海、云南、四川、陕西、山东、安徽、河北、 天津和北京等20多个番茄主产区大范围发生，特别是对我国北方秋茬保护地和南方露地 番茄生产造成了极其严重的损失。
[0003] 双生病毒分为四个属，玉米线条病毒属、甜菜曲顶病毒属、番前伪曲顶病毒属和菜 豆金色花叶病毒属。菜豆金色花叶病毒属多数为双组份基因组，即DNAA和DNAB。少数为单 组份基因组，其基因组结构只有DNAA。有些单组份菜豆金色花叶病毒属病毒成员常伴随有 其它小分子卫星DNA，包括卫星DNA0及卫星DNAa等，被伴随的这些菜豆金色花叶病毒属 病毒称为辅助病毒，DNAP已被证明为致病因子，能够影响辅助病毒在寄主中的积累，又是 引起典型症状不可缺少的因子，它与辅助病毒之间没有序列同源性，并且必须依赖于辅助 病毒进行复制、包裹和移动。在田间自然发病的植株中，这些单组份双生病毒常与其伴随的 卫星DNA形成病害复合体，有的伴随一种卫星DNA，有的伴随两种，例如双生病毒/DNA0病 害复合体、双生病毒/DNAa病害复合体、双生病毒/DNAP/DNAa病害复合体等。
[0004] 番茄黄化曲叶病毒属于菜豆金色花叶病毒属病毒，是一种单组份双生病毒。番茄 植株感染番茄黄化曲叶病毒病后，初期主要表现为生长迟缓或停滞，植株节间变短，植株明 显矮化，叶片变小变厚；叶质脆硬，叶片有褶皱、向上卷曲，叶片边缘至叶脉区域黄化，植株 上部叶片症状比较典型，下部老叶症状不明显。由于番茄黄化曲叶病毒和越南卫星DNA0 有潜在的致病力增强的威胁，且复合侵染的产区正在扩大，开发能同时检测两种成分的特 异、简便和灵敏的方法对这种病害的新疫情的早期预警和及时防控具有现实意义。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种同时检测番茄黄化曲叶病毒和/或越南 卫星DNA0的方法。
[0006] 为解决上述问题，本发明首先提供了引物组。
[0007] 本发明所提供的引物组，由引物对TY和引物对0组成；
[0008] 所述引物对TY由名称为TY-F的引物和名称为TY-R的引物组成；所述TY-F为序 列表中序列1所示的单链DNA;所述TY-R为序列表中序列2所示的单链DNA;
[0009] 所述引物对e由名称为e-F的引物和名称为e-R的引物组成；所述e-F为序 列表中序列4所示的单链DNA;所述0 -R为序列表中序列5所示的单链DNA。
[0010] 所述引物对TY也属于本发明的保护范围。
[0011] 所述引物对0也属于本发明的保护范围。
[0012] 本发明还提供了所述引物组、所述引物对TY或所述引物对0的制备方法。
[0013] 所述引物组的制备方法可包括将所述引物组中各条引物分别单独包装或所述引 物组中各条引物的量按照1:1:1:1比例混合在一起。
[0014] 所述引物对TY的制备方法可包括将所述TY-F和所述TY-R分别单独包装或所述 TY-F的量和所述TY-R的量按照1:1比例混合在一起。
[0015] 所述引物对P的制备方法可包括将所述P-F和所述P-R分别单独包装或所述 0 -F的量和所述0 -R的量按照1:1比例混合在一起。
[0016] 本发明还提供了试剂盒A、试剂盒B和试剂盒C。
[0017] 所述试剂盒A含有所述引物组。
[0018] 所述试剂盒B含有所述引物对TY。
[0019] 所述试剂盒C含有所述引物对0。
[0020] 所述试剂盒A可为将反应试剂A和空白对照组装在一起得到的产品。
[0021] 所述试剂盒B可为将反应试剂B和空白对照组装在一起得到的产品。
[0022] 所述试剂盒C可为将反应试剂C和空白对照组装在一起得到的产品。
[0023] 所述反应试剂A，可包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 18. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(浓度为 10ymol/ L)0. 5yL、TY-R(浓度为 10ymol/L)0. 5yL、0-F(浓度为 10ymol/L)0. 5yL和 0-R(浓 度为 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0024] 所述反应试剂B，可包括lOXEasyTaqBuffer(含Mg2+)2.5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、0-F(浓度为 10ymol/ 1)〇.5 1^和0-1?(浓度为1〇4111〇1/1)〇.5 1^，共241^〇
[0025] 所述反应试剂C，可包括 10XEasyTaqBuffer(含Mg2+) 2. 5yL、TaqDNA聚合 酶（5U/yL) 0? 5yL、ddH20 19. 0yL、dNTP(2. 5mmol/L) 1. 0yL、TY-F(浓度为 10ymol/ L) 0? 5yL和TY-R(浓度为 10ymol/L) 0? 5yL，共 24yL。
[0026] 所述空白对照为灭菌超纯水，使用时加入1yL。
[0027] 所述lOXEasyTaqBuffer(含Mg2+)为北京全式金生物技术有限公司产品，目录号 为API11-02 的"EasyTaqDNAPolymerase" 中的组件。
[0028] 下述cl)_c6)中至少一种应用也属于本发明的保护范围：
[0029] cl)上述任一所述试剂盒A检测待测样本中是否含有或疑似含有番茄黄化曲叶病 毒和/或越南卫星DNA0中的应用；
[0030] c2)上述任一所述试剂盒A检测待测病毒是否为候选的番茄黄化曲叶病毒或越南 卫星DNA0中的应用。
[0031] c3)上述任一所述试剂盒B检测待测样本中是否含有或疑似含有番茄黄化曲叶病 毒中的应用；
[0032] c4)上述任一所述试剂盒B检测待测病毒是否为候选的番茄黄化曲叶病毒中的应 用；
[0033] c5)上述任一所述试剂盒C检测待测样本中是否含有或疑似含有越南卫星DNA0 中的应用；
[0034] c6)上述任一所述试剂盒C检测待测病毒是否为候选的越南卫星DNAP中的应用。
[0035] 下述al)_a9)中至少一种应用也属于本发明的保护范围：
[0036] al)上述任一所述引物组制备用于检测番茄黄化曲叶病毒和/或越南卫星DNA0 的试剂盒中的应用；
[0037]a2)上述任一所述引物组检测待测样本中是否含有或疑似含有番茄黄化曲叶病毒 和/或越南卫星DNA中的应用；
[0038]a3)上述任一所述引物组检测待测病毒是否为候选的番茄黄化曲叶病毒或越南卫 星DNAI3中的应用；
[0039]a4)上述任一所述引物对TY制备用于检测番茄黄化曲叶病毒的试剂盒中的应用；
[0040]a5)上述任一所述引物对TY检测待测样本中是否含有或疑似含有番茄黄化曲叶 病毒中的应用；
[0041] a6)上述任一所述引物对TY检测待测病毒是否为候选的番茄黄化曲叶病毒中的 应用；
[0042] a7)上述任一所述引物对制备用于检测越南卫星DNAI3的试剂盒中的应用；
[0043]a8)上述任一所述引物对检测待测样本中是否含有或疑似含有越南卫星DNA0 中的应用；
[0044] a9)上述任一所述引物对0检测待测病毒是否为候选的越南卫星DNAP中的应 用。
[0045] 本发明还提供了如下dl)_d3)中至少一种方法：
[0046] dl) -种检测待测样本是否含有番茄黄化曲叶病毒和/或越南卫星DNAP的方法， 可包括如下步骤：
[0047] 提取待测样本的基因组DNA，以上述任一所述引物组进行PCR扩增，然后进行如下 评判：（1)如果PCR扩增产物中含有DNA分子1、则待测样本中含有或疑似含有番茄黄化曲 叶病毒，如果PCR扩增产物中不含有DNA分子1、则待测样本中不含有或疑似不含有番茄黄 化曲叶病毒；（2)如果PCR扩增产物中含有DNA分子2、则待测样本中含有或疑似含有越南 卫星DNA，如果PCR扩增产物中不含