的PCR扩增产物中同时含有与序列表中序列6具有98. 56%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列22所示）和序列表中序列3具有98. 08% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列23所示），判断该样本中含有或疑似含有番茄黄化曲叶病毒和越南 卫星DNAP，该判断结果与通过发病表征判断的结果一致；
[0127] 样品编号为11的PCR扩增产物中同时含有与序列表中序列6具有98. 14%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列24所示）和序列表中序列3具有99. 04% -致性的核苷酸 序列（如序列表中序列25所示），判断该样本中含有或疑似含有番茄黄化曲叶病毒和越南 卫星DNAP，该判断结果与通过发病表征判断的结果一致；
[0128] 样品编号为12的PCR扩增产物中只含有与序列表中序列3具有97. 80%-致性 的核苷酸序列（如序列表中序列26所示），判断该样本中含有或疑似含有番茄黄化曲叶病 毒，该判断结果与通过发病表征判断的结果一致。
[0129] 上述实验结果表明，结果表明，本发明提供的试剂盒A可准确的检测番茄黄化曲 叶病毒和/或越南卫星DNA0。
[0130] 实施例4、实施例2的试剂盒的特异性
[0131] 以实施例2的制备的试剂盒A或试剂盒B或试剂盒C进行特异性实验，具体步骤 如下：
[0132] 1、用DNA提取试剂盒提取待测病毒（番茄黄化曲叶病毒、越南卫星DNAP、或中国 番木瓜曲叶病毒）的基因组DNA，基因组DNA的浓度均为140ng/yL。
[0133] 2、完成步骤1后，向试管中加入24yL反应试剂（反应试剂A、反应试剂B或反应 试剂C)和1yL待测病毒的基因组DNA得到反应液，进行PCR扩增，反应结束后，将PCR扩 增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用PCR产物胶回收试剂盒回收，进行测序。PCR 反应程序为：94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 个循环：72°ClOmin。
[0134] 按照上述步骤将待测病毒的基因组DNA替换为灭菌超纯水作为空白对照，其它步 骤均不变。
[0135] 3、结果判定：如果待测病毒的PCR扩增产物中含有DNA分子1，则待测病毒为候选 的番茄黄化曲叶病毒；如果PCR扩增产物中含有DNA分子2,则待测病毒为候选的越南卫星 DNA0;如果PCR扩增产物中既不含有DNA分子1又不含有DNA分子2,则待测病毒为候选 的非番前黄化曲叶病毒和非越南卫星DNA0。
[0136] 实验结果如下：（1)向反应试剂A或反应试剂B中加入番茄黄化曲叶病毒的基因 组DNA进行PCR扩增，其PCR扩增产物只含有DNA分子1。（2)向反应试剂A或反应试剂C中加入越南卫星DNA 的基因组DNA进行PCR扩增，其PCR扩增产物只含有DNA分子2。 (3)除上述⑴和⑵外，反应试剂（反应试剂A、反应试剂B或反应试剂C)中加入待测病 毒的基因组DNA进行PCR扩增，均没有得到PCR扩增产物。结果表明，本发明提供的试剂盒 A能特异性的检测番茄黄化曲叶病毒和/或越南卫星DNA0，试剂盒B能特异性的检测番茄 黄化曲叶病毒，试剂盒C能特异性的检测越南卫星DNA0，同时试剂盒（试剂盒A、试剂盒B 或试剂盒C)均与其他病原微生物无交叉反应，如中国番木瓜曲叶病毒。
[0137] 实施例5、实施例2的试剂盒的灵敏度
[0138] 一、标准品质粒的获得
[0139] 将序列表的序列7所示的双链DNA分子与载体pMD18-T连接，得到重组质粒 pMD18-TY(标准品质粒甲）。将标准品质粒甲命名为DNA1。DNA1中DNA浓度为1yg/ml。
[0140] 将序列表的序列8所示的双链DNA分子与载体pMD18-T连接，得到重组质粒 PMD18-0 (标准品质粒乙）。将标准品质粒乙命名为DNA8。DNA8中DNA浓度为1yg/ml。
[0141] 二、试剂盒A的灵敏度
[0142] 将上述步骤一中DNA1与DNA8等体积混合，命名为DNAa，DNAa中DNA浓度为1yg/ ml〇
[0143] 1、用无菌超纯水稀释DNAa，得到DNAb、DNAc、DNAd、DNAe和DNAf。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0144] 2、向试管中加入24yL反应试剂A和1yL步骤1制备的DNAa得到反应液，进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物a。反应程序为：94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 个循环：72°ClOmin。
[0145] 按照上述方法，将DNAa分别替换为步骤1制备的DNAb、DNAc、DNAd、DNAe、DNAf和 灭菌超纯水，其它步骤均不变，分别得到PCR扩增产物b、PCR扩增产物c、PCR扩增产物d、 PCR扩增产物e、PCR扩增产物f?和PCR扩增产物g。
[0146] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物均进行0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测。
[0147] 实验结果见图3 (图3中M为Trans2KplusDNAMarker，1为PCR扩增产物a，2 为PCR扩增产物b，3为PCR扩增产物c，4为PCR扩增产物d，5为PCR扩增产物e，6为PCR 扩增产物f，CK为PCR扩增产物g)。结果表明，本发明提供的试剂盒A对等量混合的番茄 黄化曲叶病毒和越南卫星DNAI3质粒DNA的最小检测限为Ing/mL。
[0148] 三、试剂盒B的灵敏度
[0149] 1、用无菌超纯水稀释DNA1，得到DM2、DM3、DNA4、DNA5 和DNA6。使用Beckman UV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0150] 2、向试管中加入24yL反应试剂B和1yL步骤1制备的DNA1得到反应液，进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物 1。反应程序为：94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 个循环：72°ClOmin。
[0151] 按照上述方法，将DNA1分别替换为DNA2、DNA3、DNA4、DNA5、DNA6和灭菌超纯水， 其它步骤均不变，分别得到PCR扩增产物2、PCR扩增产物3、PCR扩增产物4、PCR扩增产物 5、PCR扩增产物6和PCR扩增产物7。
[0152] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物均进行0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0153] 实验结果见图1 (图1中M为Trans2KplusDNAMarker，1为PCR扩增产物1，2 为PCR扩增产物2, 3为PCR扩增产物3,4为PCR扩增产物4, 5为PCR扩增产物5,6为PCR 扩增产物6,CK为PCR扩增产物7)。结果表明，本发明提供的试剂盒B对番茄黄化曲叶病 毒质粒DNA的最小检测限为Ing/mL。
[0154] 四、试剂盒C的灵敏度
[0155] 1、用无菌超纯水稀释DNA8,得到DNA9、DNA10、DNA11、DNA12 和DNA13。使用 BeckmanUV-800紫外分光光度计测定稀释后各个梯度的DNA浓度，分别为Ing/mL、lpg/mL、 1*10 7yg/mL、1*10 8yg/mL和 1*10 9yg/mL。
[0156] 2、向试管中加入24yL反应试剂C和1yL步骤1制备的DNA8得到反应液，进行 PCR扩增，得到PCR扩增产物 8。反应程序为：94°C3min;94°C30s，55°C30s，72°Clmin，30 个循环：72°ClOmin。
[0157] 按照上述方法，将DNA8分别替换为DNA9、DNA10、DNA11、DNA12、DNA13和灭菌超纯 水，其它步骤均不变，分别得到PCR扩增产物9、PCR扩增产物10、PCR扩增产物11、PCR扩 增产物12、PCR扩增产物13和PCR扩增产物14。
[0158] 3、将步骤2得到的PCR扩增产物均进行0. 8 %琼脂糖凝胶电泳检测。
[0159] 实验结果见图2 (图2中M为Trans2KplusDNAMarker，1为PCR扩增产物8, 2 为PCR扩增产物9,3为PCR扩增产物10,4为PCR扩增产物11，5为PCR扩增产物12,6为 PCR扩增产物13,CK为PCR扩增产物14)。结果表明，本发明提供的试剂盒C对越南卫星 DNA0质粒DNA的最小检测限为Ing/mL。
[0160] 实施例6、利用实施例2制备的试剂盒A检测待测样本
[0161] 1、待测样本的准备：
[0162] A、用牙签接种法将番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆接种健康番茄叶片，得到待测样 本一。具体接种步骤如下：
[0163] (1)用番茄黄化曲叶病毒侵染性克隆和根癌农杆菌EHA105制备含有病毒侵染性 克隆的农杆菌（制备方法见文献：王祥.北方部分省市番茄黄化曲叶病毒的检测鉴定及辣 椒分离物侵染性克隆构建[D]:山东农业大学.2013)。
[0164] (2)将含有病毒侵染性克隆的农杆菌单克隆接种在5mLYEP液体培养基（含50mg/ L卡那霉素和50mg/L链霉素）中，28°C、200rpm振荡培养24- 4