AAT CCACCCCTTTCATTACATCCTGTAAGAAGAGTTTCTAAACACTCCAGGCAGGCACTACTACTCCAGTCGGAGTCTTC GGGAGCAATAATGTTTAGCATCTTATATACATTTAGCAATGCTAACTGGCGCTGTTGCTGCCCTTGCTTTAACAGCT AACCCACGAATACCGGAATTCCCGCAGGTCGCTCTCTCAGCCGGACCGGCGGCATCCCTTCCCCTCCCGGCTCCCCC TGGGGGCCGATCCACGAACAGTCGTGCCTTACAGTTTACCAGGTAGAAAAGTGTAACCCTGAGAAGCAGCGTTTGTT GGTGAGACGCCGCCACGTGCAAAGGCTCAGCCTGACCGCACACACACACGTGGGTTCCACAGCCAGCTGCGGGGCTT TCCCTTTGGTTTCTAATCACAAAGAAACCTCCCTCCTGAGCCACAGCTGAAACACATATAACAGCTCGAGCTCGCGT GCTCTTTTTTCTTGAATGCTTGGGGGGAGGCGTTGTTAGGCTACAGCCCTGAAGAGCGAGGGTACGTGGAGG ATCTGTGTTTGTTTCTATTGCTGCATTCACTGGCTTctcgagatctgcgatctaagtaagctt
[0019] 与现有技术相比，本实用新型具有以下有益效果：第一，本实用新型通过设计特异 性引物，PCR扩增和RFLP方法，使得产物更具特异性，保证了 SNP分型的准确性并确定对公 鸡性早熟有显著遗传效应的突变位点。第二，本实用新型通过对GDF9基因5'调控区不同 基因型载体的构建，细胞转染和双报告基因检测启动子活性，验证了启动区不同基因型启 动子活性，确保了实验结果的准确性，并使实验者省去了构建载体的繁琐步骤。第三，本实 用新型设计合理，使用方便、结果可靠且成本低廉。
【附图说明】
[0020] 图1是本实用新型公鸡性早熟相关基因--⑶F9基因5'调控区SNP分型及启动 子活性快速检测试剂盒的结构示意图；
[0021 ] 图2是细胞铺板示意图；
[0022] 图3是细胞转染示意图；
[0023] 图4是启动子活性检测示意图；
[0024] 图中：1盒盖，2上层盒体，3下层盒体，4衬垫，5低温层，6引物混合物， 7DNA Tag酶扩增缓冲液，8内切酶缓冲液，9dNTP，10转染试剂，111 XPBS，12DNA Tag 酶，13 内切酶（Hin6I)，14 质粒 1(pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter)，15 质粒 2 (pGL3-GDF9-333-IT-Basic/promoter)，16 质粒 3 (pGL3-Basic)，17 质粒 4 (pRL-CMV)，18 双 荧光素酶试剂Oual-Glo Luciferase Reagent)，19双荧光素酶终止反应底物（Dual-Glo Stop&Glo Substrate)，20 双焚光素酶缓冲液（Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer)。
【具体实施方式】
[0025] 结合具体实施例和附图对本实用新型作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于 说明目的，而不用于限制本实用新型范围。
[0026] 如图1所示，本实用新型公鸡性早熟相关基因--⑶F9基因5'调控区SNP分 型及启动子活性快速检测试剂盒由盒体、衬垫4、、低温层5、用于GDF9基因5'调控区 PCR扩增的上下游引物混合物6、DNA Tag酶扩增缓冲液7、内切酶缓冲液8、dNTP9、转染 试剂 KK1XPBS11、DNA Tag 酶 12、内切酶（Hin6I)13、质粒 l(pGL3-GDF9-333-GG-Basic/ promoter) 14、质粒 2 (pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promoter) 15、质粒 3 (pGL3_Basic) 16、质 粒4&虬-01^)17、双荧光素酶试剂（0皿1-61〇1^(^€6四86 1^&861^)18、双荧光素酶终止 反应底物（Dual-Glo Stop&Glo Substrate) 19、双焚光素酶缓冲液（Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer) 20 组成。
[0027] 盒体为双层结构，包括上层盒体2和下层盒体3。下层盒体为低温层。上、下层盒 体2、3内均设有衬垫4,衬垫上设有孔腔。
[0028] 用于⑶F9基因5'调控区PCR扩增的上下游引物混合物6、DNA Tag酶扩增缓冲液 7、内切酶缓冲液8、dNTP9、转染试剂10、1XPBS 11分别装在上层盒体衬垫孔腔内。
[0029] DNA Tag 酶 12、内切酶（Hin6I)13、质粒 l(pGL3-GDF9-333-GG-Basic/ promoter) 14、质粒 2 (pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promoter) 15、质粒 3 (pGL3_Basic) 16、质 粒4&虬-01^)17、双荧光素酶试剂（0皿1-61〇1^(^€6四86 1^&861^)18、双荧光素酶终止 反应底物（Dual-Glo Stop&Glo Substrate) 19、双焚光素酶缓冲液 Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer 20分别装在下层盒体衬垫孔腔内。
[0030] 盒体横截面可以是椭圆形。
[0031] 上述试剂盒还包括盒盖1，盒盖盖合在盒体上。盒盖1可以是椭圆形。
[0032] 本实用新型试剂盒的使用方法：
[0033] 1、PCR扩增SNP位点所在片段
[0034] 1) PCR扩增反应体系准备
[0035] PCR的反应体系为25yl，其中包括：
[0036]
【主权项】
1. 公鸡性早熟相关基因一一GDF9基因5'调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂 盒，包括盒体，其特征是，所述盒体为双层结构，盒体包括上层盒体（2)和下层盒体（3)，上、 下层盒体内均设有衬垫（4)，衬垫上设有孔腔；所述下层盒体为低温层（5); 上层盒体（2)衬垫孔腔内分别设有用于GDF9基因5'调控区PCR扩增的上下游引物混 合物（6)、DNA Tag酶扩增缓冲液（7)、内切酶缓冲液（8)、dNTP (9)、转染试剂（10)、1 X PBS (11); 下层盒体（3)衬垫孔腔内分别设有DNA化g酶（12)、巧n6I内切酶（13)、 pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promote;r 质粒 1 (14)、pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promote;r 质 粒 2 (15)、p化3_Basic 质粒 3 (16)、p化-CMV 质粒 4 (17)、Dual-Glo Luciferase Reagent 双巧光素酶试剂（18)、Dual-Glo Stop & Glo Substrate双巧光素酶终止反应底物（19)、 Dual-Glo Luciferase Reagent Buffer 双巧光素酶缓冲液（20)。
2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征是，所述盒体横截面是楠圆形。
3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征是，所述盒体上设有盒盖（1 )，盒盖（1)为楠 圆形。
【专利摘要】公鸡性早熟相关基因—GDF9基因5’调控区SNP分型及启动子活性快速检测试剂盒，包括上、下层盒体（2、3）、衬垫（4）、衬垫上的孔腔，下层盒体设有低温层（5）；上层盒体衬垫孔腔内分别设有引物混合物（6）、DNA Tag酶扩增缓冲液（7）、内切酶缓冲液（8）、dNTP（9）、转染试剂（10）、1×PBS（11）；下层盒体衬垫孔腔内分别设有DNA Tag酶（12）、Hin6I内切酶（13）、pGL3-GDF9-333-GG-Basic/promoter质粒1（14）、pGL3-GDF9-333-TT-Basic/promoter质粒2（15）、pGL3-Basic质粒3（16）、pRL-CMV质粒4（17）、双荧光素酶试剂（18）、双荧光素酶终止反应底物（19）、双荧光素酶缓冲液（20）。本实用新型保证了SNP分型的准确性并确定对公鸡性早熟有显著遗传效应的突变位点，确保了实验结果的准确性，并使实验者省去了构建载体的繁琐步骤。
【IPC分类】C12M1-00, C12Q1-68
【公开号】CN204369862
【申请号】CN201420686033
【发明人】李春苗, 黎寿丰, 赵振华, 黄华云, 王钱保, 梁忠, 陈连颐, 薛龙岗
【申请人】江苏省家禽科学研究所
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2014年11月14日