3是DNA片段杂交样品的酶切图谱。Μ代表DNAMarker，图中标出了相关的三 条标准条带l〇〇bp、250bp和500bp，紧接着DNAMarker的分别是DNA片段杂交样品和其酶 切产物。图中1、2、3分别用于标识酶切产物形成的三条条带。
【具体实施方式】
[0033] -、基于酶切灵敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒的原理 酶切如限制性内切酶酶切是基因多样性/突变检测的一种简便和经济的方法，用于酶 切的目的基因片段是通过靶向其两端保守区域的引物对扩增得到的；对于复合模板如杂合 子来源的核酸样本，若其中的扩增片段含量低则难以通过酶切法准确识别该片段。肿瘤是 体细胞疾病，由于体细胞突变组分只占临床等样本中的一部分，除此之外还可能存在大量 的野生型基因，因此采用常规的酶切法无法保证此类样本基因突变检测的灵敏度需求。
[0034] 针对常规酶切法在EGFR基因突变检测中的不足，本发明提出了连接抑制的方法 进行改进，图1是其原理示意图。本发明以EGFR基因的29种常见突变为对象，设计了靶向 各突变位点处的连接引物（SEQ.IDNO. 9-SEQ.IDN0. 17)，使得各对连接引物的5'端和3' 端序列和野生型基因对应突变位点的区域毗邻互补(连接引物形成的环状构造两端和模板 完全互补并且毗邻)。由于在EGFR基因外显子的扩增体系中引入了耐热的DNA连接酶，则退 火阶段（~50°C)时DNA连接酶将会连接位于野生型模板上的毗邻互补的连接引物两端从 而形成闭环的连接引物，而由于与突变型模板结合的连接引物两端在毗邻处（即突变位点 处）没有和模板完全互补则不被连接。当体系处于下一阶段即72°C延伸时，由于结合于野 生型模板上的长闭环连接引物退火温度高于72°C，因此仍位于原处从而阻止野生型模板的 扩增；而对于突变型模板，由于结合的是连接引物两端短的区域，其退火温度均低于60°C， 则在72°C的温度下开环连接引物将和模板分离，因而不会阻碍模板的扩增。
[0035] 假定肿瘤样本基因组中野生型模板的含量有100,突变模板含量只有1，目的片段 以2的指数次方进行扩增；如果以连接引物对于野生型模板扩增的平均抑制效率仅为20%， 则野生型目的片段的扩增产量为100X[2X(1-20%)]η (η为扩增循环数)，突变型目的片段 的扩增产量为2η;经过21个循环，突变型目的片段的含量将超过野生型目的片段。由此可 知通过本发明方法将使得最终样品中的野生型EGFR基因片段的扩增受到有效的抑制，而 突变型的扩增则基本不受影响；因此使得突变含量低至1%的样品其最终的扩增产物中突 变片段的比例高于50%。在此基础上，通过混合对照体系和正常体系扩增产物，并经变性和 退火操作，制备在突变位点处含有错配构造的DNA片段杂交样品，从而实现了错配切除酶 对于杂合基因片段样品的有效检测。
[0036]由于是先通过正常体系扩增产物电泳检测情况识别突变发生位点所在的区域，进 而决定酶切操作的进行的；因此一般仅需要一次酶切或无需进行酶切从而有效降低了检测 成本。此外由于有对照体系扩增产物做为杂交样品的本底，因此本发明方法可以有效排除 EGFR外显子的多态性位点而只检测突变位点。本发明首次构建了循环DNA聚合和循环DNA 连接联合体系，并且进一步优化了聚合和连接联合体系中各组分的含量和比例，最终结合 设计的靶向常见的EGFR基因突变位点处的连接引物将其引入到EGFR基因突变的检测中； 此外利用简单的变性退火操作使得突变以错配构造的形式显现，进而利用错配切除酶实现 简便的酶切检测。其中的各技术参数及应用构成了对应于本发明方法的试剂盒。
[0037] 二、实施例 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不限于此。
[0038] 本实施例以健康人血细胞扩增得到的EGFR基因片段为野生型模板，将其克隆到 大肠杆菌工程菌中；利用重叠延伸PCR获得突变型的EGFR基因片段，将其克隆到大肠杆菌 工程菌中，由此分别构建了EGFR基因野生型和突变型细胞系，在此基础上建立基于酶切灵 敏检测人类EGFR基因突变的方法及其试剂盒。主要包括以下步骤： (1)试剂盒中各组分的选用。
[0039] 本发明试剂盒各组分选用信息如表6所示。
[0040] 表6试剂盒组分选用信息
表6组分中，rTaqDNA聚合酶的酶活力单位浓度为5U/uL，TaqDNA连接酶的酶活力 单位浓度为4000U/uL，两者均具有良好的耐热性能，T7核酸内切酶I的酶活力单位浓度为 lOOOOU/mLo
[0041] (2)杂合样本制备和基因组DNA提取 采用本发明扩增引物，参照文献（肖莉，EGFR基因缺失突变检测新技术及其应用于游 离DNA检测的可行性.苏州大学博士学位论文，2014 ;赵静，非小细胞肺癌EGFR基因突变 检测试剂盒的开发.北京协和医学院博士学位论文，2011)中的方法构建含有EGFR基因第 18-21四个外显子野生型和其上常见的29种突变型的AcWiDH5a工程菌细胞系，通过 TA克隆、蓝白斑筛选和测序鉴定获取转入目的片段的阳性AcWiDH5a克隆子。然后用 LB液体培养基培养阳性克隆子，按照EGFR基因第18-21四个外显子野生型菌等比例混合得 到总的野生型菌（下面简称野生型菌)，按总的野生型菌：突变型菌浓度比为100 :1混合即 得到了含有1%突变细胞比例的杂合体样本。本实施例选择的是EGFR20即第20号外显子 的T790M(6240)这一突变类型的混合菌样本，共三组平行。采用TaKaRa公司的MiniBEST BacteriaGenomicDNAExtractionKitVer. 3.0 提取样本的基因组DNA，共得到 50uL。 各样本基因组DNA的电泳未出现降解且亮度很好，证明提取效果良好；经测定提取量为 l-2ug，A260/A280均位于1. 8-2. 0之间，符合扩增所需的量和纯度。
[0042] (3)EGFR基因特定片段扩增 对于每个样本，采用本发明试剂盒分别配制上述的5管扩增体系，各管体系使用的扩 增引物和连接引物组参照表3,其余组分均相同如表7所示： 表7EGFR基因外显子扩增体系（25uL)
同时配制对应的5管不含连接引物、耐热DNA连接酶缓冲液和耐热DNA连接酶这三种 组分的对照扩增体系，扩增引物参照表3,体系配制参照表7,所缺组分添加量由灭菌去离 子水替补。
[0043] 对于每个样本，共5管正常体系(含连接酶体系）和5管对照体系（不含连接酶体 系)在基因扩增仪上进行EGFR基因片段的扩增，扩增条件均为：95°C预变性5min;94°C变性 10s，50°C退火 30s，72°C延伸lmin，循环 32 次；72°C终延伸lOmin。
[0044] ( 4 )扩增产物的电泳分析 所有的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在0. 5ug/ml的EB溶液中染色20min并用清 水脱色后置于凝胶成像系统上拍照和分析。电泳图谱如图2所示，左右1-5泳道分别为对 照体系和正常体系的1-5管的扩增产物。以北京天根公司的D2000DNAMarker条带为标 准(普通条带浓度约为10ng/uL)，EGFR20的T790M突变的对照体系均可以成功扩增出目的 基因片段，其亮度肉眼显见与DNAMarker的一般条带相近即其目的扩增产物浓度明显高于 5ng/uL;而正常体系中只有第3管的扩增产物条带明亮，肉眼显见与DNAMarker的一般条 带相近即其目的扩增产物浓度明显高于5ng/uL，而其余4管的扩增产物条带肉眼显见非常 微弱(浓度明显远低于5ng/uL)。三组平行结果一样，因此均选取正常体系的第3管和对照 体系的第3管备用。
[0045] (5)DNA片段杂交样品的制备 将（4)中选取的正常体系和对照体系的扩增产物，按照10uL正常体系扩增产物、5uL对 照体系扩增产物、2uL10XPCR缓冲液和3uL去离子水共20uL添加到PCR管中。将PCR 反应管置于PCR仪中98°C孵育5min，之后停止加热并在PCR仪中放置30min使之缓慢冷 却，即制得DNA片段杂交样品。
[0046] (6 )DNA片段杂交样品的酶切分析 取8uL步骤（5)中的DNA片段杂交样品到新的无菌PCR管中，加入0. 25uLT7核酸内 切酶I和luL10XT7核酸内切酶I缓冲液，用水补足10uL;将PCR管放入PCR仪中进行酶 切操作，程序为：37°C保温60min进行酶切反应，80°C保温lOmin灭酶，即得到了酶切产物。 将10uL酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，同时也包括酶切前样品即DNA片段杂交样品，电泳 结果如图3所示。酶切产物一共得到了三条条带，标记为1的条带同DNA片段杂家样品条 带一致，应该是样品未完全酶切导致的；条带2和3是新产生的，参照DNAMarker，条带3的 片段大小符合l〇〇bp，条带2的片段大小符合350bp，即带型符合EGFR20的T790M(6240)突 变的理论酶切带型。其余两组平行的结果也一样。
[0047] (7)样品EGFR突变结果判定 以DNAMarker条带为标准，在对照体系正常扩增的情况下，鉴于第3管即EGFR20的T790M(6240)突变检测体系出现明显扩增产物，且由其和对应对照体系制备的DNA片段杂 交样品经T7核酸内切酶I酶切，酶切产物的带型同T790M(6240)突变的理论酶切带型一 致，因此判定所检测样品含